近年来,由于抗生素的不合理使用,导致耐药菌在全球范围内不断蔓延,致使世界范围内每年超过700,000人死于耐药菌感染,严重威胁着人类健康。而多重耐药革兰氏阴性菌的出现更是给临床治疗带来了巨大挑战,原因是治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的药物非常有限。为解决这个问题,多粘菌素——这类古老抗生素又被重新应用于临床,并被视为是治疗某些多重耐药革兰氏阴性菌感染的最后一道药物防线。然而,在2015年末,我国学者首次报道了由质粒介导的黏菌素耐药基因——mcr-1（mobile colistin resistance）,其不仅可以纵向传递,还能够在不同种属的细菌之间水平转移,引起国际范围内的广泛关注,这也使得多粘菌素这一最后的药物防线被打破,增大了泛耐药菌在全球范围内传播的风险。当前,非抗生素类与抗生素类药物联合应用正在成为一种非常有价值的应用疗法,既可以恢复抗生素对耐药菌的效力,又不会对细菌施加选择性压力。因此,由mcr-1基因编码的蛋白质——MCR-1蛋白,可作为药物设计的靶标,通过设计合成小分子化合物来抑制MCR-1蛋白的生物活性,从而恢复mcr-1阳性耐药菌对多粘菌素的敏感性,为临床多粘菌素耐药问题提供解决方案。在课题研究之初,尚未见MCR-1小分子抑制剂的报道,本课题首次以MCR-1蛋白为靶标,借助计算机辅助药物设计手段,对MCR-1蛋白小分子抑制剂在细菌水平、蛋白水平以及动物水平进行了系统的生物活性评价。本课题研究内容主要分为以下部分:1.以MCR-1蛋白为靶标的小分子抑制剂的发现本论文以MCR-1蛋白（PDB code:5GRR）为靶标,借助计算机辅助药物设计的手段,对自有化合物库中8000+个小分子进行虚拟筛选,共筛选出30个化合物作为候选分子。随后,本课题构建了表达全长mcr-1基因的E.coli BL21（DE3）作为活性评价体系,对筛选出的30个候选化合物进行生物活性测试,其中,消旋体化合物str5329能够使表达mcr-1基因的BL21（DE3）恢复对黏菌素的敏感性,且其自身对测试菌株的生长没有抑制作用。因此,本课题将str5329作为结构优化的先导化合物,设计并合成了35个全新结构的化合物。经细菌水平的活性测试后,共有9个化合物的生物活性高于str5329,其中,化合物23和25在25μΜ下即可使表达mcr-1基因的BL21（DE3）恢复对黏菌素的敏感性,生物活性最优。根据活性测试结果,本课题对化合物进行了初步的构效关系分析:化合物生物活性的发挥主要是由R¹、R⁴和R⁵基团共同作用而形成的,即当R¹位置为脂肪烃基取代（环己基、己基或辛基）、R⁴位置为羧基、R⁵位置为烷氧基取代时,化合物才可发挥生物活性,且生物活性随着R¹位置碳链的延长而升高。在R¹位置为己基或辛基取代的活性化合物中,R²位置甲基基团的引入可使化合物的生物活性提高,而R³位置甲基基团的引入则使化合物的生物活性下降。这为小分子化合物的进一步合理优化提供了基础。2.在蛋白水平验证活性化合物具有MCR-1蛋白抑制活性为了证实化合物对MCR-1蛋白具有抑制作用,本课题选取了先导化合物str5329、活性化合物23和25以及无活性化合物18在酶水平进行实验。活性测试结果表明str5329、化合物23或25均对MCR-1蛋白介导的磷酸乙醇胺（PEA）转移反应具有抑制作用,其中,化合物25对MCR-1蛋白的抑制活性最优,而化合物23或25对MCR-1蛋白的抑制活性远远优于str5329。另外,在细菌水平未表现出生物活性的化合物18,其对MCR-1蛋白介导的PEA转移反应也没有表现出明显的抑制作用,说明细菌水平与蛋白水平的生物活性测试结果是一致的,进一步证实了活性化合物是通过抑制MCR-1蛋白的生物活性从而使表达mcr-1基因的BL21（DE3）恢复对黏菌素的敏感性。为了进一步探讨化合物结构与MCR-1蛋白抑制活性之间的关系,本课题将化合物与构建的全长MCR-1蛋白进行了分子对接分析。其中,活性化合物如化合物23或25能够很好地占据MCR-1蛋白的空腔,与MCR-1蛋白的活性位点在空间结构上相互匹配,且与关键氨基酸Glu246和Thr285通过氢键相互作用。此外,本论文还发现化合物的两种构型在与MCR-1蛋白之间的相互作用模式上没有表现出明显差异,说明化合物的构型可能对MCR-1蛋白抑制活性的发挥没有影响。这为MCR-1小分子抑制剂的进一步研究奠定了基础。3.在动物水平对化合物25的生物活性研究在完成了细菌水平以及蛋白水平的生物活性测试后,本论文选择化合物25在动物水平进行生物活性测试,通过建立小鼠急性腹膜炎感染模型,考察化合物25或黏菌素单独用药与化合物联合黏菌素用药对小鼠存活率、肝脏带菌量以及肝脏病理损伤情况的影响。实验结果表明,与化合物25(10 mg·kg^-1)或黏菌素(7.5 mg·kg^-1)单独用药组相比,化合物25(10 mg·kg^-1)联合黏菌素(7.5 mg·kg^-1)用药组小鼠的存活率明显提升、肝脏带菌量有所下降、肝脏的炎性反应显著减轻,即化合物25联合黏菌素用药对感染小鼠的治疗效果优于黏菌素单独用药。4.Nebivolol作为MCR-1蛋白抑制剂的发现从现有药物中发现新的用途可以大大缩短从药物研发到临床应用的时间,为临床疾病的治疗提供解决办法。由此,本论文对FDA库即已上市药物与MCR-1蛋白也进行了分子对接,并筛选出了9个药物分子作为候选化合物。经细菌水平的生物活性测试后,首次发现了Nebivolol能够使表达mcr-1基因的BL21（DE3）恢复对黏菌素的敏感性,并在酶水平证实了Nebivolol对MCR-1蛋白介导的PEA转移反应具有抑制作用,即Nebivolol具有MCR-1蛋白抑制活性。接下来,本课题将对Nebivolol与黏菌素的联合应用进行更深入的研究,期望能够为mcr-1耐药菌感染的临床治疗提供新思路。综上所述,本论文以MCR-1蛋白为靶点,借助计算机辅助药物设计的手段,筛选得到了具有MCR-1蛋白抑制活性的化合物str5329,本课题将str5329作为先导化合物进行结构优化,经细菌水平的生物活性测试后,共得到了9个生物活性高于str5329的化合物,其中,化合物23和25的生物活性最优;随后,在蛋白水平对活性化合物做了机制研究,化合物23或25都对MCR-1蛋白介导的PEA转移反应具有抑制作用;在动物水平的生物活性测试结果中,化合物25联合黏菌素用药的治疗效果优于化合物25或黏菌素单独用药,这为MCR-1小分子抑制剂的进一步研究奠定了基础。此外,本课题从FDA库中筛选得到了Nebivolol,首次发现并证实了Nebivolol具有MCR-1蛋白抑制活性,将Nebivolol与黏菌素联合用药期望能够为mcr-1耐药菌感染的临床治疗提供新思路。