本研究从临床问题出发,发现问题,进一步从细胞和分子层面进行验证,并探讨其机制。本课题分为三部分:1、探讨肿瘤相关巨噬细胞浸润(TAMs)、胃癌细胞EMT和胃癌干细胞在胃癌组织中的相关性及临床意义;2、应用克隆形成及悬浮培养分离AGS细胞不同克隆,即Holoclone、Meroclone和Paraclone,分离鉴定出胃癌干细胞;3、巨噬细胞对人胃癌细胞EMT及肿瘤干细胞的影响及相关机制的研究。方法:1.采用免疫组织化学法检测236例胃癌组织肿瘤相关巨噬细胞及肿瘤干细胞标记物的表达情况,分析胃癌组织中肿瘤相关巨噬细胞与上皮-间质转换和肿瘤干细胞的相关性、临床病理因素以及与肿瘤复发和患者预后预后之间的关系。2.将胃癌细胞AGS用含细胞因子EGF、bFGF的DMEM/F12的培养基出不同细胞克隆,分析不同细胞克隆形成集落的能力和自我更新能力,细胞免疫荧光法鉴定紧密克隆分化的异质性和干细胞标记物表达情况。3.应用ELISA法分别检测人胃癌细胞系AGS、人巨噬细胞及二者共培养体系中培养液上清中IL-6的浓度;应用WesternBlot的方法比较外源性IL-6作用于人胃癌细胞系AGS后肿瘤干细胞标志物CD44的变化情况;应用细胞划痕实验检测外源性IL-6对胃癌细胞运动、迁移能力的影响;应用Transwell侵袭小室检测外源性IL-6对胃癌细胞侵袭能力的影响;应用WestemBlot的方法检测巨噬细胞分泌的IL-6是否通过活化STAT3信号通路促进胃癌干细胞表型,并促进肿瘤细胞迁徙。结果:1.CD163+肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的高表达与肿瘤恶性生物学特征相关,尤其是肿瘤复发密切相关。在胃癌组织中存在肿瘤干细胞相关标志物的高表达和肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)标记CD163之间存在显著相关性。对于有复发患者,CD163+肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的高表达是一个独立的不良预后因素。结论:肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)大量与肿瘤恶性生物学行为相关,与肿瘤干细胞标志物CD44和CD133的异常表达有关,而且是一个独立的预后不良因素。靶向针对胃癌组织中肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的药物可能成为胃癌,包括复发患者,潜在的治疗策略。2.克隆形成结果发现胃癌细胞AGS克隆形成率为9.67±1.21%(n=6)。根据克隆形态将其分为紧密型,中间型和松散型三类。三种类型的克隆所占比例分别为15.1%,65.6%和19.3%。利用免疫细胞染色来自Holoelone克隆的细胞,结果发现Holoelone克隆可向胃肠上皮分化并高表达肿瘤干细胞标记物CD44。Holoelone克隆不仅形成了与原有克隆类似的Holoclone克隆,还可形成Merodone及Paraclone克隆,表明Holoclone来源的细胞具有自我更新能力。3.人巨噬细胞及其与人胃癌细胞系AGS共培养体系中培养液上清中IL-6浓度显著高于人胃癌细胞系AGS(P<0.001);IL-6在人胃癌癌内与癌旁组织中均有表达,其表达无个体与组织特异性,而IL-6与CD163二者在人胃癌癌内与癌旁组织中表达存在正相关性(P<0.0001);外源性IL-6可促进胃癌细胞的运动迁移能力及侵袭能力:外源性IL-6可以通过STAT3途径激活CD44,从而使细胞向肿瘤干细胞样表型转化,并发生上皮-间质转变。结论:1.CSCs标记物在肿瘤组织中表达异常升高,并且与胃癌的大小、浸润的深度、分化程度、TNM分期情况、淋巴结转移程度等肿瘤恶性生物学行为以及患者预后情况相关密切。2.肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)大量与肿瘤恶性生物学行为相关,与肿瘤干细胞标志物的异常表达有关,而且是一个独立的预后不良因素。3.胃癌细胞株AGS细胞形成的克隆在形态和分化程度上具有异质性。通过克隆形成能够从胃癌细胞AGS细胞分选、筛查出肿瘤干细胞,即紧密型克隆(holoclone)。来自Holoclone克隆的细胞具有自我更新、多向分化等肿瘤干细胞的特性。4.巨噬细胞胞通过IL-6/STAT3信号通路上调CD44表达,促进胃癌干细胞表型和胃癌细胞侵袭迁徙。