论文部分内容阅读
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA),是一类可以在多种微生物胞内积累的一种聚合物。PHA具有良好的生物可降解性和生物相容性。作为一种绿色材料,近年来在生物医药、环境和包装材料等领域受到了广泛的关注。聚3-羟基丁酸戊酸共聚酯[Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate),PHBV],是一种最为常见的短链PHA。极端嗜盐古菌是一类可以积累PHBV的微生物。解淀粉盐颗菌(Halogranum amylolyticum TNN58)以葡萄糖为碳源可以在胞内积累类似PHA的颗粒状物质。气相色谱-质谱法(GC-MS)和核磁共振(NMR)实验分析表明,该颗粒状物质为PHBV。透射电子显微镜(TEM)分析显示,细胞内存在大量PHA颗粒。H.amylolyticum TNN58以葡萄糖为碳源积累的PHBV中3HV的摩尔比例高达20~21%。这是目前已报道的,利用非基因工程菌和非相关碳源积累PHBV的最高值。考察了NaCl对菌体生长和PHBV积累的影响,确定最适NaCl浓度为18%。通过实验,确定了MG培养基较有利于PHBV的积累。在MG的基础上优化了发酵培养基和培养条件。在7L发酵罐中,通过分批补料补充碳源,在发酵结束时,DCW达29 g/L,PHBV浓度达到14 g/L。通过在培养基中添加丙酸,发现H.amylolyticum TNN58积累的PHBV中3HV含量明显增加。在本研究中,首先由两种不同类群的微生物H.amylolyticum TNN58和罗氏真养菌(Ralstonia eutropha H16)发酵合成3HV摩尔百分比为21%的PHBV材料——PHBV-HA和PHBV-RE。采用气相色谱,凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography,GPC),差示扫描量热法(different scanning calorimetry,DSC),热重分析法(thermo gracimetric analysis,TGA)和万能试验机等系统研究了两种聚合物的材料学性能。实验结果表明,它们表现出了不同的材料学特性,特别是在热稳定性,熔融温度,结晶度和机械性能方面,都存在明显的不同。通过SEM和接触角实验考察了材料的表面特征,通过溶血实验和血小板吸附实验,评价了材料的血液相容性。结果显示,PHBV-HA的溶血率和血小板粘附性能明显低于PHBV-RE。由H.amylolyticum合成的PHBV-HA材料,具有更好的血液相容性,因此该材料在加工成与血液接触的生物制品方面,具有更大的潜力。通过Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers(CODEHOPs)and Higheffi-ciency thermal asymmetric interlaced(hiTAIL)PCR方法成功克隆了H.amylolyticum TNN58的PHA合酶基因。测序结果表明,克隆得到了一段长度为4364 bp的片段,该片段是一个包含了4个基因的基因簇。氨基酸序列的比对结果显示,这四个基因分别是phaE,phaC,phaP和phaR。其中,phaE和phaC这两个基因是H.amylolyticum TNN58的PHA合酶基因。phaP基因的表达产物PhaP蛋白是PHA颗粒结合蛋白。phaR基因的表达产物PhaR蛋白是PHA合成的一个调控蛋白。随后,将phaE和phaC导入H.hispanica PHB-1(PHA合酶敲除株)中,对其编码蛋白的功能进行了验证。通过RT-PCR和Western blot实验,发现phaE和phaC在H.hispanica PHB-1中进行了转录和翻译。遗传互补实验表明H.hispanica PHB-1/pWL102-phaEC可以积累PHBV。这说明,来自于H.amylolyticum TNN58的PhaEC具有PHA合酶的活性。本研究还通过鸟枪法对其进行了全基因组测序。利用Velvet进行组装,得到32个scaffolds,整个基因大小约为4.71M,测序深度为218X。通过对基因组数据进行分析,成功预测出与PHA合成相关的其它基因。同时也对该菌的其它碳代谢重要途径进行了分析和预测。本研究的结果,为揭示H.amylolyticum TNN58的PHBV合成途径和后续的功能基因组学研究的提供了基础数据。