丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)为黄病毒科丙型肝炎病毒属(Hepacivirus)的唯一成员,是引起输血后非甲非乙型肝炎的主要致病因子。目前全球约有1.7亿HCV感染者,其中我国的感染者近4千万。HCV感染的慢性率高达70%以上,与肝硬化以及肝细胞癌高度相关,严重危害人类健康。HCV基因组为单股正链RNA,长约9600 nt,由一个高度保守的5′NTR,一个长约9000 nt的开放读码框架(ORF)和一个3′NTR组成。ORF编码全长约3000个氨基酸的前体蛋白,通过宿主细胞及病毒多蛋白自身的蛋白酶切割产生至少十种不同的蛋白,包括结构蛋白:核心蛋白、E1、E2、p7、和非结构蛋白:NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。缺乏小动物感染模型是HCV研究一直所面临的难题,近两年来虽然建立了感染性的HCV细胞培养模型,但仅限于有限的基因型,这些给HCV感染的防治研究带来了很大困难。目前, HCV感染的标准疗法是聚乙二醇化的IFN-α与RBV的联合应用,2、3型HCV感染对该疗法的持续反应率达75%以上,但流行最广的1型HCV感染的持续反应率不到50%。此外,该疗法的费用昂贵,还具有副作用。HCV分子克隆以来,HCV疫苗在欧美发达国家一直是研究热点,但迄今为止,尚无任何有效的疫苗问世。探索新的更加有效的HCV治疗方法,研发确实有效的HCV疫苗非常迫切。一、RNA干扰在抗HCV感染中的作用RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指由小的双链RNA(small interfering RNA, siRNA,小干扰RNA)引发的与之有同源序列的mRNA的降解,从而导致特定基因沉默(gene silencing)的现象或机制。2000年被发现以后,RNA干扰被迅速应用于功能基因组学以及病毒感染、肿瘤以及遗传病的基因治疗等领域。大量研究证明,siRNA可作为抗病毒感染的有力工具。病毒体与宿主细胞表面受体的结合是病毒进入细胞的第一步骤,在此过程中病毒体表面的蛋白起决定性作用。虽然HCV进入靶细胞的确切机制现在仍不十分清楚,但一系列确凿的证据表明这与HCV包膜糖蛋白E2与靶细胞表面的多种受体相关分子的结合有关,其中,CD81分子是介导HCV感染的最关键受体分子。CD81分子属于四跨膜蛋白(tetraspanin)超家族成员,又称TAPA-1,是跨膜四次、分子量为26 kD的细胞表面非糖基化蛋白,为HCV入侵细胞所必需依赖的分子,因而,E2与CD81的结合可作为抗HCV感染的重要干预事件。在该部分论文中,我们以HCV E2蛋白及CD81作为靶分子,探讨靶向这两个蛋白编码基因的siRNA的抗HCV作用。靶向HCV E2基因的RNA干扰:首先建立了一个简便直观的siRNA筛选方法,以EGFP为报告基因,构建EGFP与HCV E2融合基因表达质粒。根据HCVE2基因的序列设计2段siRNA,用体外转录的方法制备siRNA。将融合基因表达质粒以及siRNA共转染人胚肾293T细胞,用荧光显微镜观察细胞内绿色荧光的强度,初步判断siRNA对E2基因表达的抑制效果,然后用流式细胞术、Western blot和荧光定量PCR分别在蛋白水平、mRNA水平分析siRNA的作用效果。结果表明,我们设计的两段siRNA均能有效抑制E2基因的表达。对于每种siRNA,在转录、翻译水平进行的检测结果是一致的。随后用这两段siRNA转染HCV全基因组复制子细胞HepG2-HCV,48 h后用荧光定量PCR分析细胞内的HCV RNA水平,发现这两段E2特异的siRNA可分别将HCV复制水平降低70.5%和55.4%。靶向人CD81分子的RNA干扰:设计了六段CD81特异的siRNA,其中四段靶向ORF区,两段靶向3′NTR区,首先用293T细胞进行筛选,发现六段siRNA以不同效率抑制CD81的表达,其中靶向3′NTR的两段最为有效。随后用这六段siRNA转染人肝癌细胞株Huh7.5细胞,用流式细胞术检测细胞表面的CD81,发现这六段siRNA可不同程度地下调Huh7.5细胞表面CD81分子的表达,也以靶向3′NTR区的两段siRNA作用最强,分别将Huh7.5细胞表面的CD81分子的表达降低77%和82%。随后,构建了CD81的siRNA表达质粒pGCsi-CD81,转染Huh7.5细胞,用G418筛选抗性克隆。2~3周后,抗性细胞克隆形成,挑取单个克隆细胞扩大培养,用流式细胞术检测克隆细胞表面CD81分子的表达。与scramble siRNA表达质粒转染的阴性对照细胞相比,每个克隆细胞表面的CD81表达均有不同程度的降低,最低降至阴性对照细胞的8%。挑取两个CD81表达最低的细胞克隆用感染性HCV假型病毒颗粒(HCVpp)进行感染,用流式细胞术检测感染细胞的百分比,与阴性对照细胞相比,该两个克隆细胞的感染率分别降低了90%和72%。用MTT法分析这两个细胞克隆的增殖特性,发现与对照细胞相比,CD81被稳定干扰的细胞生长受到抑制,且生长抑制程度与CD81表达水平明显负相关。在这部分实验中,E2特异的siRNA可抑制HCV RNA在细胞内的复制, CD81特异的siRNA可阻止HCVpp的细胞入侵,证明无论是靶向HCV基因组的还是靶向参与HCV细胞入侵的宿主细胞受体分子的siRNA都可以起到很好的抗HCV作用,因此,基于siRNA的抗HCV疗法可能具有良好的应用前景。在对真核细胞基因进行RNA干扰研究时,研究者通常选择ORF作为靶点,本研究证明在干扰hCD81基因时,3′NTR也是很好的靶点。另外,构建的CD81表达被稳定抑制的Huh7.5细胞株在CD81分子的生物学功能以及HCV感染机制的研究中有重要用途。二、HCV包膜E2蛋白DNA疫苗诱导小鼠抗体应答HCV包膜E2蛋白是介导HCV感染及诱导中和抗体的关键蛋白,是丙肝疫苗的重要候选靶抗原。E2氨基末端的含有27个氨基酸残基的高变区1(hypervariable region 1,HVR1)是HCV蛋白中变异频率最高的区域,也是公认的HCV中和抗体表位所在区域。HVR1的高度变异曾被认为是遏制丙肝疫苗发展的瓶颈问题。然而,近几年来以感染性假HCV颗粒(HCVpp)以及细胞培养产生的HCV(HCVcc)为模型进行的病毒中和试验发现,HVR1并不是唯一的中和抗体表位所在区域,在HCV包膜E2蛋白中还存在保守的空间构象和线性中和抗体表位。本研究分别构建了羧基端截短的含有HVR1和缺失HVR1的E2蛋白以及全长E2蛋白的真核表达质粒,以之免疫小鼠,分析HVR1抗体与总E2抗体在数量与功能(病毒中和活性)方面的关系。分别构建H77株(1a型)以及J4株(1b型)HCV E2蛋白的全长表达质粒(E2746)、截除第661位氨基酸残基羧基端的表达质粒(E2661),以及同时截除HVR1的表达质粒(E2661Δ),其中E2661与E2661Δ基因的羧基端融合了6个组氨酸残基的编码序列。分别将六种质粒转染HEK 293T细胞,用6×His单抗、E2多抗以及构象依赖的单抗对细胞培养上清以及细胞裂解液进行检测,结果表明:E2661、E2661Δ表达质粒能分泌表达E2蛋白,HVR1不影响E2蛋白的表达和分泌,也不影响E2的空间构象。对细胞裂解液以及培养上清中的E2蛋白进行相对定量,再用ELISA分析H77株及J4株的E2661和E2661Δ与大肠杆菌表达的Trx(硫氧还蛋白)-CD81(LEL)(大胞外环)融合蛋白的结合情况。结果表明,HVR1不影响E2蛋白与CD81 LEL的结合,胞内的E2与CD81 LEL的亲和力明显高于分泌至培养上清中的E2与CD81 LEL的亲和力,而H77株E2与CD81 LEL的亲和力明显高于J4株E2与CD81 LEL的亲和力。分别将编码H77株E2表达质粒pcDNA3.1-1a746、pcDNA3.1-1a661、pcDNA3.1-1a661Δ以及空载体pcDNA3.1肌肉注射接种BALB/c小鼠,每组6只,剂量200μg/只,共注射3次,两周一次,定期从小鼠眼眶采血,用E2表达质粒转染的293T细胞的培养上清或裂解液检测小鼠血清中的E2抗体,以大肠杆菌表达的Trx与H77株HVR1融合蛋白检测HVR1抗体。结果:1a746质粒免疫小鼠仅有一只抗E2抗体和抗HVR1抗体阳转,而1a661及1a661Δ质粒免疫的两组在第二次免疫后各有5、2只小鼠抗E2抗体阳转,其中1a661组小鼠全部产生HVR1抗体。第三次免疫后,两组各有6、3只小鼠抗E2抗体阳性。比较两组小鼠血清中E2抗体的相对水平,1a661组小鼠E2抗体水平明显高于1a661Δ组,在1a661组小鼠中,HVR1抗体水平并不与E2抗体水平平行。用1a661Δ或J4株E2661检测小鼠血清抗体,结果与用1a746或1a661检测的相似。用H77株HCVpp分析小鼠血清的中和作用,结果发现,1a661质粒免疫小鼠血清的中和作用与血清中的总E2抗体水平无明显相关,而与HVR1抗体水平呈现一定的正相关。1a661Δ质粒免疫血清的中和作用基本与总E2抗体水平相平行,但E2抗体水平相似的1a661与1a661Δ质粒免疫血清中,前者的病毒中和作用明显强于后者。由于CD81分子的表达水平影响HCV的感染效率,因此我们观察了Huh7.5细胞表面CD81表达上调对小鼠血清中和作用的影响。用人CD81慢病毒感染Huh7.5细胞,再进行病毒中和试验,结果发现,1a661Δ质粒免疫血清的中和作用明显降低,1a661质粒免疫血清的中和作用也有下降,但下降幅度较低,中和作用总体上仍与HVR1抗体水平相平行。以上结果表明:①HVR1对HCV E2蛋白的表达、分泌以及构象无明显影响;②除了HVR1以外,在E2蛋白中确切存在其他的中和抗体表位;③HVR1抗体在量上仅占截短的分泌型E2蛋白所诱导的总E2抗体中的小部分,但却是中和抗体的主要部分,相对于针对HVR1以外表位的中和抗体,其中和活性不受靶细胞表面CD81表达水平的明显影响;④针对HVR1以外的表位的中和抗体可能主要通过阻断E2与CD81的结合而阻断HCVpp的感染;⑤H77株与J4株E2蛋白具有较高程度的交叉抗原性;⑥分泌表达有利于HCV E2蛋白DNA疫苗诱导抗体反应,而仅胞内表达则明显不利于抗体的诱导;⑦HVR1不仅能作为B细胞表位诱导中和抗体,还可能含有重要的辅助性T细胞表位,能明显增强E2蛋白的免疫原性。三、小结1、采用一种简便直观的方法筛选出六段能有效抑制HCV E2基因或hCD81基因表达的siRNA。E2特异的siRNA可明显降低HCV全基因复制子细胞HepG2-HCV中HCV RNA的复制,CD81基因特异的siRNA可以抑制HCVpp对靶细胞入侵。这为RNA干扰应用于抗HCV感染奠定了基础。2、分别构建了全长以及羧基端截短的含有HVR1和缺失HVR1的E2蛋白真核表达质粒,以之免疫小鼠,分析小鼠的抗体应答以及抗体对HCVpp的中和活性。结果发现,就分泌表达的E2所诱导的抗体而言,HVR1抗体在总中和抗体中占重要位置,其中和作用受靶细胞表面的CD81表达的影响较小。与HVR1抗体相比,虽然针对HVR1以外表位的抗体在数量上占绝对优势,但中和活性明显不及HVR1抗体。此外,HVR1的作用不仅仅在于作为中和抗体表位,还可能作为重要的辅助性T细胞表位,能明显增强E2蛋白的免疫原性。这些信息对于HCV疫苗的研发有较为重要的理论意义。