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视神经损伤后保护RGCs存活和促进轴突再生的有效途径已成为当前国内外研究的热点。近年,Fischer (2000,2001)、Leon (2000) 及Lorber(2002)分别通过离体和在体实验证明:晶状体损伤可激发“神经保护性物质”的释放,保护RGCs存活、促进损伤的视神经长距离再生。但是,晶状体损伤释放的“神经保护性物质”是什么?目前尚不清楚。Leon的研究发现损伤晶状体后有大量巨噬细胞浸润视网膜,认为巨噬细胞也发挥了重要的作用。但巨噬细胞的浸润与视神经再生时间上存在较大的不一致性,因此,仅以巨噬细胞的作用难以完全解释。现已证实:晶状体是蛋白质含量最高的组织,晶体蛋白(α、β、γ)占晶状体内蛋白总量的90%～95%。晶体蛋白不仅作为一种自身抗原可剌激机体产生免疫反应,促进巨噬细胞的局部聚集;而且α晶体蛋白的亚基(αA和αB)作为小分子量热休克蛋白,能抑制介导细胞凋亡的caspase-3的激活,对视网膜色素上皮细胞、光感受器细胞以及晶体上皮细胞具有保护作用。那么,晶体蛋白对RGCs是否有保护作用呢?目的:建立Long Evans大鼠RGCs离体培养方法及鉴定技术。分别用晶体蛋白和巨噬细胞培养液对大鼠RGCs进行离体培养,研究晶体蛋白是否对离体培养的RGCs的存活和生长具有促进作用?是直接作用,还是通过激活巨噬细胞间接发挥作用?从而探讨损伤晶状体促进RGCs的存活和轴突再生的确切作用物质,为视神经损伤和再生的基础研究提供理论依据,为临床治疗视神经损伤探索可行方法。方法:提取大鼠晶体蛋白,制备巨噬细胞培养液并建立Long Evans大鼠RGCs离体培养方法及鉴定技术。而后分别用晶体蛋白、晶体蛋白激活的巨噬细胞培养液、DMEM激活的巨噬细胞培养液及DMEM对RGCs进行离体培养,观察RGCs在体外存活的时间,测量培养1、3、5d有突起的RGCs数目、最长突起长度及细胞活性,并进行组间比较。结果:1、离体培养的视网膜神经节细胞存活时间:晶体蛋白或DMEM激活的巨噬细胞培养液组及对照组离体培养的细胞分别于7~8d,6~7d,5~6d崩解死亡,而晶体蛋白组细胞能存活12~14d,细胞存活时间较其它三组显著延长(P<0.05)。2、有突起的视网膜神经节细胞数目:培养1、3、5d,各实验组有突起的RGCs数目均明显多于对照组(P<0.01)。晶体蛋白组有突起的RGCs数依次为:24.33±0.99个/0.27mm2,<WP=9>31.90±1.07个/0.27mm2,32.73±0.79个/0.27mm2;晶体蛋白激活巨噬细胞培养液组依次为:16.27±0.64个/0.27mm2,26.93±0.94个/0.27mm2,27.67±0.78个/0.27mm2;DMEM激活巨噬细胞培养液组依次为:16.13±0.55个/0.27mm2,26.13±1.11个/0.27mm2,26.80±0.82个/0.27mm2;对照组依次为:9.27±0.76个/0.27mm2,14.33±0.49个/0.27mm2,15.87±0.77个/0.27mm2。并且,晶体蛋白组与两组巨噬细胞培养液组比较,有突起的RGCs数目也明显增多(P<0.01)。而晶体蛋白激活的巨噬细胞培养液组与DMEM激活的巨噬细胞培养液组比较无显著差异(P>0.05)3、视网膜神经节细胞最长突起长度:培养1、3d,各实验组RGCs的最长突起长度均较对照组显著延长(P<0.01)。培养5d时,晶体蛋白组和晶体蛋白激活的巨噬细胞培养液组RGCs的最长突起长度与对照组比较差异非常显著(P<0.01),而DMEM激活的巨噬细胞培养液组与对照组比较差异显著(P<0.05)。培养1、3、5d,晶体蛋白组RGCs最长突起长度依次为:52.18±1.10μm,118.56±2.44μm,167.83±2.42μm;晶体蛋白激活的巨噬细胞培养液组依次为:42.68±1.03μm,77.53±1.45μm,125.99±2.32μm;DMEM激活的巨噬细胞培养液组依次为:39.70±0.71μm,76.19±1.56μm,120.29±1.45μm;对照组依次为:32.20±0.99μm,69.56±1.07μm,114.15±1.48μm。两组巨噬细胞培养液组间比较差异不显著,但晶体蛋白组与两组巨噬细胞培养液组比较,RGCs的最长突起长度差异非常显著(P<0.01)。4、视网膜神经节细胞活性:培养1d时,各实验组细胞活性与对照组无明显差异。培养3d和5d时,晶体蛋白组细胞活性(0.55±0.02,0.51±0.01)显著高于对照组(0.32±0.02,0.31±0.02)(P<0.01),而DMEM激活的巨噬细胞培养液组(0.35±0.03,0.32±0.02)与对照组差异不显著。两组巨噬细胞培养液组间无显著差异。结论:1、晶体蛋白对离体培养的RGCs的存活和生长具有显著的直接促进作用,其最佳有效浓度为10-5g/L。晶体蛋白也可通过激活巨噬细胞对离体培养的RGCs的存活和生长间接发挥促进作用,但以直接促进作用为主。2、巨噬细胞培养液可促进离体培养的RGCs的存活和生长,这种促进作用与巨噬细胞的激活物无关。并且其促进作用弱于晶体蛋白(10-5g/L)的作用。