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研究背景与目的:表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因的T790M突变是一代EGFR-TKIs最常见的获得性耐药机制,约占60%。为了克服T790M突变所致的耐药,不可逆性EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)应运而生。目前,不可逆性EGFR-TKIs主要包括二代EGFR-TKIs和三代EGFR-TKIs。由于二代EGFR-TKIs在抑制T790M突变时对野生型EGFR作用过强,引发一系列剂量相关毒性,这限制了二代EGFR-TKIs在克服EGFR T790M耐药性突变中的应用。而三代EGFR-TKIs可选择性针对EGFR敏感型突变及T790M突变,而对野生型EGFR无抑制作用。不可逆性EGFR-TKIs可以抑制并且延缓EGFR T790M耐药性突变的发生,越来越多的循证医学证据表明第二、三代EGFR-TKIs一线治疗EGFR突变阳性的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)疗效优越,这给我们带来了更多的一线治疗选择。尽管如此,发生耐药却在所难免。虽然目前已有对第二代、第三代EGFR-TKIs的耐药机制的研究报道,但相比于一代EGFR-TKIs的耐药谱而言,这还远远不足。对新一代EGFR-TKIs获得性耐药机制的研究,对于阐明耐药的分子机制以及指导耐药的后续治疗均具有重要意义。本研究前期选取临床上最常见的三代、二代EGFR-TKIs:AZD9291以及阿法替尼,以EGFR 19外显子缺失的肺腺癌细胞系(HCC827)为亲本细胞,成功建立了AZD9291耐药细胞HCC827/AZDR及阿法替尼耐药细胞HCC827/AR,用来模拟AZD9291及阿法替尼初始治疗以后的耐药;在前期研究的基础上,本研究通过对耐药细胞反复鉴定,证明其耐药性与稳定性;进一步对其EGFR、下游通路、旁路途径进行初步探索,以期发现AZD9291以及阿法替尼潜在的获得性耐药机制,并找到能够克服耐药的解决办法。研究方法:1.耐药细胞的鉴定:MTS法检测EGFR-TKIs对亲本细胞HCC827、HCC827/AZDR细胞以及HCC827/AR细胞的增殖抑制率,计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)以及耐药倍数;通过反复冻融、长期去药观察耐药细胞的稳定性;细胞计数法绘制细胞的生长曲线,计算倍增时间;光学显微镜下观察细胞形态,western-blot法对EMT相关标志物进行验证。2.潜在耐药机制的筛选:通过416-癌症相关基因二代测序(Next-generation sequencing,NGS)对亲本细胞以及耐药细胞的416个癌症相关基因的突变状态及拷贝数变异等进行分析;通过RNA测序对比亲本细胞及耐药细胞的基因表达差异。通过测序技术筛选潜在的耐药相关基因。3.耐药机制的初步验证:通过Western-blot法检测EGFR、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路、磷脂酰肌醇-3-羟基酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)信号通路、以及其他酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase receptors,TKRs)的蛋白表达以及激活情况;使用特异性通路抑制剂阻断可疑的耐药通路,MTS法观察抑制剂对耐药细胞的增殖抑制,并计算两种抑制剂联合时的Chou-Talalay相互作用指数(combination index,CI)。研究结果:1.在AZD9291耐药细胞HCC827/AZDR中:(1)通过对AZD9291耐药株进行鉴定,发现其是一株对AZD9291高水平耐药及稳定的细胞株,其耐药倍数为330倍,并且发生了EMT改变;(2)通过对耐药株EGFR信号通路的探索,我们发现亲本细胞HCC827为EGFR扩增的细胞(17×),而HCC827/AZDR细胞EGFR基因的高拷贝数缺失,EGFR的蛋白表达丢失;(3)在耐药细胞中发现MAPK通路异常激活,未发现MAPK通路上关键成员基因水平的变化,而MAPK通路的一个负性调节因子双特异性磷酸酶6(dual specific phosphatase 6,DUSP6)的m RNA表达水平较亲本细胞而言显著下降;(4)HCC827/AZDR细胞对MAPK通路抑制剂(曲美替尼或SCH772984)不敏感,这是由于MAPK通路被抑制剂阻断后AKT通路发生激活,激活的AKT通路不能被AZD9291阻断,但1μmol/L的AKT通路抑制剂MK-2206或GDC-0068联合1μmol/L的MAPK抑制剂曲美替尼或SCH772984可以阻断AKT通路活化并且在一定程度上抑制HCC827/AZDR细胞的增殖;(5)HCC827/AZDR细胞中大部分耐药相关TKRs表达下降,但AXL的表达及IGF1R通路的调节蛋白IGFBP7的表达显著升高;磷酸化的AXL(Y779)的水平在亲本细胞及耐药细胞中相当;而IGF1R在耐药细胞中明显发生激活。(6)IGF1R抑制剂NVP-AEW541不能抑制HCC827/AZDR的增殖,1μmol/L的NVP-AEW541可以抑制HCC827/AZDR细胞IGF1R的磷酸化,但不能抑制MAPK通路的激活;NVP-AEW541联合曲美替尼可以抑制AKT通路的激活,并且抑制AZD9291耐药细胞的增殖。2.在阿法替尼耐药细胞HCC827/AR中:(1)通过对阿法替尼耐药株进行鉴定,发现其是一株对阿法替尼高水平耐药且稳定的细胞株,其耐药倍数为736倍;(2)我们发现亲本细胞HCC827与HCC827/AR均为EGFR基因扩增的细胞,检测到EGFR基因拷贝数分别为:21.6×与13.2×;EGFR的m RNA表达、EGFR总蛋白以及磷酸化蛋白的水平均较亲本细胞而言有所下降。虽然EGFR表达下降,但仍然处于激活状态,且此激活状态可被阿法替尼抑制。(3)在耐药细胞中发现MAPK通路在阿法替尼存在下持续异常激活,而AKT通路仍然可被0.01μmol/L的阿法替尼抑制;MAPK通路上关键基因KRAS基因拷贝数升高(8×),KRAS表达也较亲本细胞明显升高;(4)HCC827/AR细胞对曲美替尼或SCH772984不敏感,这是由于MAPK通路被抑制剂阻断后磷酸化的AKT水平增高,但激活的AKT通路可被阿法替尼阻断;(5)1μmol/L的曲美替尼或SCH772984可以部分逆转阿法替尼耐药。结论:1.AZD9291耐药细胞HCC827/AZDR的鉴定及耐药机制的研究:(1)AZD9291耐药细胞HCC827/AZDR为对AZD9291高水平耐药且长期稳定的细胞株。(2)在HCC827/AZDR中,EGFR基因高拷贝数丢失及EGFR表达下降而导致的AZD9291靶点的缺失可能是AZD9291耐药主要原因。(3)在丢失了原有驱动基因的情况下,异常活化的MAPK信号通路以及与之交联的AKT通路参与维持AZD9291耐药细胞的增殖存活,MAPK通路抑制剂与AKT通路抑制剂联合应用可作为耐药后续治疗选择之一。(4)耐药细胞中IGF1R作为旁路信号异常激活,并且参与AKT下游通路的调控,但耐药细胞的增殖不完全依赖IGF1R信号通路。MAPK通路抑制剂联合IGF1R通路抑制剂也可作为耐药后续治疗选择。2.阿法替尼耐药细胞HCC827/AR的鉴定及耐药机制的研究(1)阿法替尼耐药细胞HCC827/AR为对阿法替尼高水平耐药且长期稳定的细胞株。(2)在HCC827/AR中,EGFR表达虽然下降,但仍然处于激活状态,其依然调控AKT下游通路,并在耐药细胞的增殖存活中发挥作用(3)在本研究中,KRAS扩增可能是潜在的耐药机制,其可能通过激活MAPK信号通路使其不再受上游EGFR的调控,而使细胞对阿法替尼耐药。MAPK通路抑制剂联合阿法替尼可作为阿法替尼耐药的后续治疗选择。