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目的:本研究旨在通过大黄素甲醚(Physcion)体外干预人急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)细胞系NALM6、SUPB15,并靶向调节细胞系中HOXA5(homeotic genes A5,HOXA5)基因的表达,探讨大黄素甲醚对细胞周期及细胞凋亡的影响,为大黄素甲醚治疗ALL提供实验基础。方法:1.细胞培养:采用体外细胞培养技术培养人ALL细胞系。2.实验分组:实验选用两种人ALL细胞系NALM6、SUPB15。(1)首先根据大黄素甲醚不同的干预浓度(0μM、2μM、5μM)将细胞系NALM6细胞、SUPB15细胞分别分为三组;(2)siRNA下调HOXA5基因后分别将NALM6细胞及SUPB15细胞分为空白对照组、siRNA干预组、大黄素甲醚干预组、siRNA+大黄素甲醚干预组;(3)转染过表达质粒上调HOXA5基因后将NALM6细胞及SUPB15细胞分为空白对照组、HOXA5基因过表达组、大黄素甲醚干预组、HOXA5基因过表达+大黄素甲醚干预组。3.CCK8(cell counting kit-8,CCK8)检测:(1)检测不同浓度的大黄素甲醚干预24h、48h、72h、96h后对两种ALL细胞系细胞增殖的影响情况;(2)同时确定大黄素甲醚的最佳干预浓度及干预时间;(3)检测转染靶向HOXA5基因的siRNA及过表达质粒后,各组细胞在不同时间点的细胞活力。4.实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测:不同浓度大黄素甲醚干预48h后检测各组细胞中HOXA5基因的mRNA表达水平。5.蛋白免疫印迹法检测:(1)检测不同浓度大黄素甲醚干预48h后,各组细胞中HOXA5基因的蛋白表达情况;(2)检测转染靶向HOXA5基因的siRNA和过表达质粒后,各组细胞中HOXA5基因的蛋白表达情况;(3)检测剪切活化的caspase-3、剪切活化的聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)基因和Bcl-2相关的X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)基因等凋亡相关基因及周期相关基因Cyclin D1的蛋白表达水平。6.[~3H]-胸腺嘧啶核苷([~3H]thymidine ribotide,[~3H]-Td R)掺入法检测细胞增殖:评估通过大黄素甲醚、靶向siRNA抑制HOXA5基因的表达及过表达HOXA5基因等干预方法对细胞增殖的影响。7.细胞凋亡的检测:(1)检测不同浓度的大黄素甲醚干预不同时间后两种ALL细胞系的细胞凋亡情况;(2)检测靶向HOXA5基因的siRNA和过表达质粒转染两种ALL细胞系后,各组细胞的凋亡情况。8.细胞周期检测:(1)检测不同浓度的大黄素甲醚干预一定时间后两种ALL细胞系的细胞周期情况;(2)检测靶向HOXA5基因的siRNA和过表达质粒转染两种ALL细胞系后,各组细胞的周期情况。结果:1.大黄素甲醚通过诱导ALL细胞的凋亡及细胞周期阻滞从而抑制细胞生长。(1)大黄素甲醚干预两种ALL细胞系后,细胞活力呈剂量和时间依赖性降低;(2)[3H]-TdR掺入法检测到大黄素甲醚以剂量依赖性方式抑制ALL细胞增殖;(3)大黄素甲醚诱导ALL细胞凋亡呈剂量依赖性;(4)大黄素甲醚干预后,ALL细胞中的caspase-3和PARP呈剂量依赖性激活;(5)大黄素甲醚剂量依赖地诱导ALL细胞周期G1期停滞。2.大黄素甲醚通过下调HOXA5基因的表达发挥其抗白血病细胞作用。(1)大黄素甲醚以剂量依赖的方式抑制HOXA5基因的mRNA表达;(2)大黄素甲醚以剂量依赖性的方式抑制HOXA5基因的蛋白质表达;(3)大黄素甲醚通过抑制HOXA5基因的表达参与调控ALL细胞的细胞周期和凋亡。3.HOXA5基因是大黄素甲醚发挥体外抗白血病细胞作用的主要靶点。3.1大黄素甲醚通过调节HOXA5基因抑制ALL细胞增殖。(1)过表达HOXA5基因的质粒显著增强HOXA5基因的蛋白表达;(2)靶向HOXA5基因的siRNA显著抑制HOXA5基因的蛋白质表达;(3)过表达的HOXA5基因显著降低大黄素甲醚对ALL细胞生长的抑制作用;(4)靶向HOXA5基因的siRNA可以增强大黄素甲醚对细胞生长的抑制作用;(5)[3H]-TdR掺入法检测到大黄素甲醚通过调节HOXA5基因对ALL细胞增殖产生影响。3.2 HOXA5基因介导大黄素甲醚的凋亡诱导作用。(1)过表达HOXA5基因降低大黄素甲醚的凋亡诱导的作用;(2)靶向HOXA5基因的siRNA促进ALL细胞中的大黄素甲醚诱导的细胞凋亡;(3)HOXA5基因的过度表达降低了大黄素甲醚对caspase-3和PARP的活化以及对凋亡相关基因表达的影响;(4)靶向HOXA5基因的si RNA可以增强大黄素甲醚对caspase-3和PARP的激活以及对凋亡相关基因的影响。3.3大黄素甲醚通过靶向下调HOXA5基因阻断ALL细胞的细胞周期进程。(1)HOXA5基因的过度表达增加了S期细胞的数量,减弱了在G1期的细胞周期阻滞;(2)靶向HOXA5基因的siRNA显著增强G1期的细胞周期阻滞;(3)HOXA5基因的过度表达增强了Cyclin D1的表达。(4)靶向HOXA5基因的siRNA降低了Cyclin D1的表达。结论:1.大黄素甲醚诱导人ALL细胞系NALM6和SUPB15中的细胞凋亡和细胞周期阻滞,从而抑制细胞生长。2.HOXA5基因的过度表达明显消除了大黄素甲醚对ALL细胞凋亡和细胞周期阻滞的诱导作用,相反,通过siRNA敲除HOXA5基因增强了大黄素甲醚对ALL细胞系的抑制作用。