研究背景:原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)是一种自身免疫性出血性疾病,总体发病率为2.0～5.3/10万人[1-3]。慢性ITP的临床表现差异较大,多数患者无症状或仅有轻微的皮肤黏膜紫癜、瘀斑,部分患者可有严重的内脏出血,如消化道、肾脏甚至颅内出血。ITP的出血风险除与血小板减少的严重程度相关外,其他因素如长期应用阿司匹林、慢性肝病等具有很大影响。ITP的发病机制极为复杂,目前认为主要涉及到以下几个方面:①抗血小板自身抗体或相关补体介导的血小板在单核-巨噬细胞系统的破坏;②细胞毒T淋巴细胞(CTLs)通过穿孔素、颗粒酶等对血小板的直接裂解;③辅助性T细胞(helper T cells,Th)介导的细胞免疫紊乱所致的血小板减少;④调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)数量削减和功能缺陷导致的血小板降低;⑤巨核细胞分化成熟障碍、凋亡受阻引起的血小板生成不良。近年研究发现,细胞免疫功能紊乱在ITP的发生及病理过程中扮演了重要角色[4-6],尤其是CD4+T细胞及相关细胞因子异常在ITP发生发展中发挥了主导作用[7-11]。Th22细胞作为新近发现的CD4+T细胞亚群,其本身及其分泌的IL-22因子是评价ITP活动性的重要标志物[4]。已有研究证明,ITP患者外周血(peripheral blood,PB)Th22等CD4+T细胞亚群平衡失调[5],然而骨髓(bone marrow,BM)中Th22细胞及其分泌的细胞因子、以及与其他细胞亚群之间的相互作用尚未见报道。BM是免疫细胞发育和血小板生成的场所,明确其微环境状态,并筛选发挥作用的关键性因子,有助于进一步阐述ITP的发病机制,探索ITP新的特异性治疗靶点。研究目的:通过分析BM及PB中Th22、Th1/Th2、Th17/Tregs和Tfh细胞及其分泌的细胞因子的表达,了解以上细胞及细胞因子之间的免疫状态,探讨这种免疫紊乱在ITP发病中的作用及机制。研究方法:应用流式细胞术分析BM和PB中CD4+T细胞中Th1/Th2、Th17/Tregs、Th22、Tfh细胞亚群的表达,并通过免疫荧光标记法(IFM)验证CD4+T细胞亚群与流式细胞术的差异;ELISA检测IFN-γ、IL-17A和IL-22因子的浓度;实时荧光定量PCR检测BMMCs和PBMCs中IL-4 mRNA的表达;基因芯片技术检测各趋化因子的含量;间接修饰的单克隆抗体俘获血小板抗原技术(MAIPA)测定血小板膜表面抗-GP Ⅱ b/Ⅲa和抗-GPIb/IX抗体;利用Pearson相关分析ITP患者和HCs组之间,T细胞亚群和相应细胞因子之间的相关性。主要结果:1.ITP患者BM和PB中Th22细胞比例均显著高于与之配对的健康对照组(healthy controls,HCs)(BM:2.18±0.80%vs.0.84 ± 0.17%,P<0.001;PB:1.39±0.61%vs.0.83 ±0.16%;P=0.001);ITP患者BM中Th22细胞比例显著高于PB(2.18±0.80%vs.1.39±0.61%,P<0.001),IL-22因子水平也表现为同样的模式(33.26±16.77 pg/ml vs.28.04±12.96pg/ml,P=0.007)。ITP患者BM和PB中Th22细胞与IL-22因子水平均呈显著性正相关(BM:r=0.796,P<0.001;PB:r=0.737,P<0.001)。2.ITP患者BM和PB中Th17细胞比例均显著高于与之配对的HCs(BM:3.38±1.18%vs.1.39±0.17%,P<0.001;PB:2.13±0.90%vs.1.32±0.22%,P=0.001);ITP患者BM和PB中Tregs细胞比例均显著低于HCs(BM:1.73±0.66%vs.6.12±0.30%,P<0.001;PB:4.05 ± 1.05%vs.6.21 ± 0.18%,P<0.001)。ITP患者BM和PB中Th17/Tregs细胞比例均显著增高且平衡失调(BM:2.27±1.18 vs.0.67±0.64,P<0.001;PB:0.67±0.64 vs.0.18±0.03,P=0.006)。ITP患者BM中IL-17A因子水平显著高于HCs(16.41±2.43pg/ml vs.13.05±3.27 pg/ml,P=0.001),PB中IL-17A因子略高于HCs,但尚未达统计学差异(15.96 ± 2.93pg/ml vs.14.77±2.85 pg/ml,P=0.232)。3.ITP患者BM和PB中Th1细胞比例均显著高于与之匹配的HCs(BM:24.62±6.37%vs.7.70±1.12%,P<0.001;PB:15.81±3.47%vs.7.11±1.33%,P<0.001)。ITP 患者 BM 中 Th1 细胞比例显著高于 PB(24.62±6.37%vs.15.81±3.47%,P<0.001),IFN-y因子水平也显著高于 PB(5.40±2.50 pg/ml vs.3.98±1.65 pg/ml,P<0.001)。4.ITP患者BM中Th2细胞比例与HCs组无显著性差异(1.47±0.51%vs.1.49±0.41%,P=0.949),而 PB 中 Th2 细胞比例显著低于 HCs(0.81±0.30%vs.1.40±0.33%,P=0.007);ITP 患者 BM 中 IL-4 mRNA 的表达与 HCs 组无明显差异(0.000345±0.000107 vs.0.000369±0.000099,P=0.630),而 PB中 IL-4 mRNA 的表达水平明显低于 HCs(0.000206±0.000038 vs.0.00033±0.000071,P=0.017)。ITP 患者 BM 中 Th2 细胞比例明显高于 PB(1.47±0.51%vs.0.81±0.30%,P=0.012),BM 中 IL-4 mRNA 的表达也明显高于 PB(0.000345±0.000107 vs.0.000206±0.000038,P=0.012)。5.免疫荧光显微镜测得的ITP患者BM中Th1细胞比例明显高于HCs(t=1.936.P=0.048);而 Tregs 细胞比例明显低于 HCs(/=2.387,P=0.015);ITP患者BM中Th17和Th22细胞比例虽有高于HCs的趋势,但尚未达明显的统计学差异(Th17:/=1.028,P=0.190;Th22:/=1.553,P=0.082)。6.ITP患者BM中CD4+CXCR5+Tfh细胞的表达明显高于PB(21.43±3.94%vs.17.01±4.47%,P=0.016),CD4+CXCR5+ICOS+Tfh 细胞也表现为一致的结果(5.42±2.56%vs.3.21±1.75%,P=0.018)。7.ITP患者BM和PB中CD4+IFN-γ+T细胞的CXCR3水平均显著高于与之匹配的 HCs(BM:1527.3±216.1%vs.1063.5±217.5%,P=0.001;PB:1705.5 ±235.1%vs.1293.7±141.6%,P=0.002);BM和PB中CD4+IL-22+T细胞的CCR4水平均显著高于 HCs(BM:2584.3±824.5%vs.1624.8 ± 217.4%,P=0.005;PB:2402.8±607.3%vs.1496.2±155.4%,P=0.008)。ITP 组 BM 中 CD4+IFN-－+T细胞的 CXCR3 水平明显低于 PB(1527.3±216.1%vs.1705.5±235.1%,P=0.033)。8.Quantibody?阵列趋化因子芯片结果显示,ITP患者BM中CCL27、骨桥蛋白(OPN)和 CCL18 水平均明显高于 HCs(CCL27:3218.39 vs.1190.38,P=0.041;OPN:8175.97 vs.2293.69,P=0.016;CCL18:807.64 vs.628.95,P=0.039),而PB中测得的40种趋化因子和细胞因子与HCs比较均没有统计学差异(均为P>0.05)。ITP患者BM中巨噬细胞移动抑制因子(MIF)水平显著高于PB(11814.48 vs.2412.42,P=0.025),而 MB 中 CCL23 水平明显低于 PB(590.24 vs.745.20,P=0.018)。9.2级和3级出血的患者,BM中Th22细胞比例略高于1级出血的患者(2.54± 0.65%vs.2.03 ± 0.72%;P=0.053),但尚未达统计学差异,而PB中则明显高于1级出血的患者(1.78±0.50%vs.1.31±0.53%;P=0.017);2级和3级出血的患者,BM中Th1细胞比例显著高于1级出血的患者(30.28±6.72%vs.24.19± 6.00%;P=0.006),而 PB 中无统计学差异(19.13±7.94%vs.17.37 ±5.02%;P=0.404)。结论:1.ITP患者BM与PB中Th22细胞亚群平衡紊乱,这种CD4+T细胞亚群的异常BM比PB更为明显。2.ITP患者BM与PB中Th1/Th2、Th17/Tregs、Tfh细胞亚群平衡失调,这些T细胞亚群的异常BM中更为显著。3.出血严重的ITP患者,Th22细胞分泌更多的细胞因子和趋化因子,患者具有更加明显的炎症反应。4.ITP患者BM中多种细胞因子及趋化因子分布异常,提示CD4+T细胞亚群的迁徙及分化共同参与了 ITP患者骨髓微环境的紊乱。研究背景:原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)是一组自身免疫性血小板过度破坏和/或生成减少所致的出血性疾病,其治疗目的主要是减少出血风险,改善患者生存质量,并非必须使血小板达到完全正常⑴,所以临床上应尽可能避免不必要的过度治疗。ITP的治疗有一线治疗和二线治疗,前者主要包括糖皮质激素和大剂量注射丙种球蛋白[2,3];后者主要有促血小板生成素受体激动剂(thrombopoietin receptor agonist,TPORA)以及包括抗CD20单克隆抗体,即利妥昔(Rituximab,RTX)在内的新型生物制剂。如果以上治疗无效,应另选择其他二线药物,如环孢素A、达那唑等。对于血小板大于30 x109/L者,若无出血症状,且无增加出血风险的危险因素时,建议临床以严密随访为主;若有增加出血风险的因素存在,至少需要治疗使血小板达到50 x 109/L;若存在出血症状,则无论血小板数量如何,都应积极的进行治疗。研究目的:通过地塞米松对ITP患者Th22、Thl/Th22、Thl7/Tregs等CD4+T细胞亚群的免疫调控,以期为ITP的免疫治疗提供理论依据。研究方法:密度梯度离心法分离PB中PBMCs,通过流式细胞术分析ITP患者治疗前后PB中Th22、Thl7/Tregs和Thl的表达;ELISA法检测PB中IL-22、IL-17A、IFN-y和TGF-P因子的浓度;血细胞分析仪检测血小板的数量;利用Pearson相关分析ITP患者治疗后各T细胞亚群与血小板数量的相关性,以及各细胞因子与血小板的相关性。主要结果:1.经地塞米松治疗一疗程后,ITP患者外周血(peripheral blood,PB)中Th22、Thl7和Thl细胞均明显降低(Th22:0.97±0.49%vs.1.39±0.61%,p=0.0282;Thl7:1.61±0.85%vs.2.13±0.90%,P=0.0387;Thl:11.38±3.43%vs.15.81±3.47%,P=0.0007);而Tregs细胞比例显著升高(5.95±2.11%vs.4.05±1.05%,P=0.0028),Thl7/Tregs比例趋于恢复。2.ITP患者治疗后较治疗前比较,PB中IFN-γ因子水平明显降低(2.84±0.82pg/mlvs3.98±1.65pg/ml,P=0.0418);而TGF-β因子明显升高(1525.0±661.3pg/ml vs 1077.3±408.4 pg/ml,P=0.0418);IL-22、IL-17A因子较治疗前有降低趋势,但尚未达统计学差异(IL-22:20.13±8.89 pg/ml vs.28.04±12.96 pg/ml,P=0.0564;IL-17A:14.13±4.39 pg/mlvs 15.96±2.93 pg/ml,P=0.1180)。3.经地塞米松治疗后ITP患者血小板数量显著升高(69.88±76.60 x 109/Lvs12.80±13.58 x109/L,P=0.0073)。4.ITP患者治疗后Th22细胞、Thl细胞与血小板数量呈明显负相关(Th22:r=-0.5330,p=0.0335;Thl:r=-0.5423,p=0.0300),Thl7细胞与血小板无相关性(r=-0.4285,p=0.0978),而Tregs细胞比例与血小板呈显著正相关r=0.6979,p=0.0026)。治疗后ITP患者IL-22、IL-17A因子与血小板数量呈显著负相关(IL-22:r=-0.6662,p=0.0048;IL-17A:r=-0.7585,p=0.0007),IFN-y因子与血小板无相关性(r=-0.0233,p=0.9317),而TGF-p因子与血小板呈显著正相关(r=0.8871,p<0.0001)。结论:1.CD4+T细胞亚群的免疫紊乱参与了ITP的发病过程,经地塞米松治疗后,患者各T细胞亚群及细胞因子逐步趋于平衡。2.通过调整CD4+T细胞亚群的平衡状态,期望为ITP的免疫治疗提供新的靶标。