胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ES cells）是从早期胚胎内细胞团或桑椹胚分离后,能在体外长期传代培养并保持高度未分化的全能细胞系。具有无限的分化潜能是其突出特点之一,即给予合适的培养条件,ES细胞可在体外分化为外、中、内胚层的任何类型类细胞。研究证明ES细胞体外向心肌细胞分化的特异基因表达图式重演了体内心肌发育基因表达,分化得到的心肌细胞具有体内正常心肌或原代培养心肌的特征和功能:（1）经由悬滴法法形成的拟胚体（Embryoidbodies,EBs）具有典型的三胚层结构;（2）分化过程中时空依赖性地表达心肌特异性转录因子和心肌特异基因;（3）分化得到的心肌细胞能够自发节律性收缩,具有典型的肌小节结构;（4）心肌细胞表面具有典型的膜结合离子通道;（5）收缩性可被心肌特异离子流激发,对激动剂反应正常。正是因为这些特征,ES细胞体外分化为心肌细胞被认为真实地重演了体内心肌分化过程,逐渐成为公认的体内心肌分化的一个替代模型用于各种目的的研究,如心脏发育生理学、心脏病理学以及心脏疾病治疗学领域的研究。在药物研究领域,该分化模型结合基因操作技术可成为心肌分化的动态生理或病理模型,用以筛选治疗心脏疾病药物并研究药物的作用机制。ES细胞分化为心肌细胞是一个渐进的过程,分为分化启动,分化发展和分化成熟阶段,而处于不同分化时期的细胞可分别称为初级前体细胞、后期前体细胞和成熟细胞。根据分化过程所体现的特点,该模型在药物研究上的应用主要有以下四个方面:（1）利用前体细胞筛选控制心肌分化的小分子药物,发展有效诱导心肌分化的药物;（2）利用前体细胞评价治疗心脏疾病的潜在药物;（3）利用分化成熟的心肌细胞设计潜在药物;（4）进行体外药物胚胎毒性筛选,预测药物的胚胎毒性。ES细胞及体外分化体系基本模拟乃至重现体内心肌分化和发育的复杂过程,富含大量心肌发育依赖性生物信息。当药物介入ES细胞的分化体系时,可特殊地干预不同分化阶段细胞内的信号转导和转录调控,从而影响相关基因和蛋白的表达,最终表现为对分化的抑制或促进。该过程高度模拟药物在整体动物的作用,重现药物与生物大分子作用时生命现象变化本质,从而探索某些心脏疾病发生起源的可能相关环节以及药物作用靶点。另外,如能发现一种药物能够有效的诱导ES细胞分化为心肌细胞,则可望与ES细胞移植治疗结合提高分化率,增强疗效。尽管关于药物诱导ES细胞体外分化为心肌细胞的研究较少,本课题前期研究发现淫羊藿苷（icariin,ICA）能够有效促进小鼠ES细胞分化为心肌细胞,表现为提高EBs的分化率,增强心肌特异性转录因子和心肌特异性基因的表达。ICA是小檗科（Berberidacae）淫羊藿属（Zpimedium）植物淫羊藿（Herba Epimedii）所含的一种黄酮苷类化合物,是该药材的主要有效成分之一,其主要药理活性在于改善心血管功能、调节机体免疫力和激素水平等。ES细胞分化为心肌细胞是一个渐进和复杂的过程。首先是心肌特异性转录因子（GATA4,Nkx2.5及MEF2C）的表达,接着启动心肌特异性基因α-肌球蛋白重链（α-myosin heavy chain,α-MHC）、心室肌球蛋白轻链（ventricular myosinlight chain-2,MLC-2v）的表达,然后所对应的收缩性蛋白开始表达,最后是肌小节蛋白α-辅肌动蛋白（α-Actinin）和肌钙蛋白T（Troponin-T）的表达,分别对应心肌细胞的分化启动,分化发生和分化成熟阶段。心肌分化过程中各事件能够准确的发生和发展是因为受到庞大的信号转导网络系统的精确调控,任何影响分化的外界因素都可通过介导该信号转导系统促进或抑制。心肌特异基因的转录,结构蛋白的表达以及离子通道的形成是ES细胞分化为心肌细胞的关键步骤,除此之外,与心肌细胞功能相关的其它事件如线粒体形成等也是非常重要的。心肌是线粒体数目最为丰富的一类细胞,随着自动节律性收缩的心肌的出现,必然伴随着线粒体数目的上调和能量需求的增加。线粒体的形成包括氧化磷酸化酶系的表达,三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle,TCA）的形成以及脂肪β氧化酶系的表达,而调控线粒体形成相关基因转录和蛋白表达主要涉及几类核转录因子及其辅激活因子,任何干扰线粒体形成的因素将会影响心肌细胞的最终分化。尽管有报道ICA影响了细胞周期的分布和P53的表达,但关于ICA的促分化作用机制还知之甚少,因此作为前期工作的延续,本研究主要目的是进一步论证ICA的促分化作用,揭示其促心肌分化的深层次机制,为阐明其诱导分化药理作用提供实验依据,也为发展其新的应用提供理论依据。本研究前期工作已证明在ES细胞分化的第5天起,培养体系加入ICA,能有效促进心肌分化。然而这种加药时间覆盖了分化发生和分化成熟两个阶段,模糊了药物的最佳作用区间,因此本研究首先在分化的不同时相明确ICA作用区间（第一部分）,因为调节作用发生在不同分化阶段的主导信号通路是存在区别的。在此基础上进一步探索与ICA促分化作用有密切关系的信号通路（第二部分）。最后,本研究将探索ICA对心肌分化过程线粒体形成相关蛋白的影响（第三部分）。1工.ICA诱导小鼠ES细胞体外分化为心肌细胞的有效作用区间研究本研究采用经典的悬滴分化培养法,评价ICA诱导ES细胞体外分化为心肌细胞的最佳作用时间。根据前期研究结果,分别在分化的第3-5 d,第5-8 d,第8-12 d加入10^-7mol/LICA。用倒置显微镜观察分化情况,以EB出现具有节律性收缩的心肌细胞团为分化成功标志,并根据EB内出现心肌细胞团的数量计算百分率并作为评价指标。采用免疫荧光法鉴定心肌特异性α-Actinin和Troponin-T表达,同时收集不同时段给药后EB总蛋白进行肌小节蛋白的检测,进一步确证ICA的最佳作用时间。实验结果显示,在分化的第3-5 d,第5-8 d,第8-12 d加入ICA后,EBs的分化百分率分别为58%,93%（P＜0.01）和62%,提示在分化的第5-8 d加入ICA为最佳作用时间。蛋白检测结果表明随着分化时间的推移,α-Actinin和Troponin-T表达逐渐上调,在分化的第10 d前表达较弱,之后有明显增强,在第12 d达到较高水平,之后变化不大,因此本研究常采用第12 d作为检测相关指标的时间点。EB在不同时间段与ICA孵育后,第12 d检测心肌特异性蛋白的表达水平,结果显示在分化的第5-8 d加入ICA能显著提高肌小节蛋白α-Actinin和Troponin-T的表达水平,并存在明显的量效关系。2.活性氧及其调控的MAPK家族激酶在ICA诱导心肌分化中的作用研究基于上述药效学研究结果,为进一步探索ICA诱导ES细胞体外分化为心肌细胞作用机制,本研究着重探索了活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）通路及其调节的MAPK家族激酶在ICA促心肌分化过程中发挥的作用。分别采用流式细胞仪和荧光显微镜检测了ICA对ES细胞和EBs内ROS水平的影响,同时检测NOX4的表达情况。另外在实验体系中共孵育抗氧化剂Trolox或NADPH酶抑制剂（Diphenyleneiodonium Chloride,DPI）后,重新评价ICA对EBs内ROS水平的影响。Western-Blot检测分化过程中和给药后细胞内p38MAPK、JNK以及ERK的磷酸化水平的变化,并观察选择[生抑制p38MAPK、JNK及ERK后对ICA诱导ES细胞分化为心肌细胞的影响。另外,在体系中共孵育DPI后,评价ICA的促分化作用和对p38MAPK的磷酸化的作用。最后采用Western-Blot法和免疫荧光法分析心肌特异性转录因子MEF-2C给药前后在细胞核和细胞质的分布情况。实验结果显示,10^-7mol/L ICA与ES细胞孵育3h后能显著提高ES内ROS的水平,该作用一直持续到6h开始有下降趋势,到9h时回降至原始水平。ICA与EBs共孵育3h后能显著提高EBs内ROS水平,同时NOX4蛋白表达上调,说明ICA能在信号源头上增强ROS相关酶的表达,是一个长时的作用。当体系中共孵育抗氧化剂Trolox或NADPH酶抑制剂DPI时,ICA促EBs内ROS产生的作用消失。结果显示在分化第5-7 d,p38MAPK、JNK以及ERK维持在一个较高的磷酸化水平,之后有下降趋势。当ICA介入培养体系后,与对照组相比,p38MAPK的磷酸化水平显著增强,维持时间延长,并呈显著的量效关系,而p-JNK及p-ERK的表达水平无明显改变。分别对p38MAPK,JNK以及ERK进行选择性抑制后,发现p38MAPK抑制剂最能有效拮抗ICA的促分化作用,表现为降低分化率,减少心肌特异性基因α-MHC和MLC-2v表达,减少α-Actinin和Troponin-T表达。另外,NADPH酶抑制剂DPI能拮抗ICA的促分化作用,并能抑制ICA引起的p38MAPK磷酸化水平升高。最后,结果尚显示ICA在活化p38MAPK的同时增强了心肌特异性转录因子MEF2C在核内的分布。上述结果提示ROS的产生可能是ICA促分化作用的始发机制,ROS产生后激活p38MAPK,p38MAPK活化MEF2C并使之往核内转移,从而增强心肌特性基因的转录和表达,最终表现为促进心肌的分化。3.ICA对心肌分化过程中线粒体起源相关蛋白表达的影响基于上述发现的p38MAPK在ICA促分化过程中的显著作用,本部分实验目的在于探索ICA促心肌分化过程中对线粒体形成相关蛋白PPARα及PGC-1α表达的影响,分为两部分:（1）采用RT-PCR,Western-blot和免疫荧光共染法,检测PPARα及其辅激活因子PGC-1α在分化过程的表达情况,选用PPARα抑制剂GW6471和激动剂WY14643进一步评价PPARα在分化过程中的作用;（2）评价ICA介入分化体系后对PPARα及PGC-1α蛋白表达的影响,同时观察选择性抑制p38MAPK后对ICA促分化,PPARα及PGC-1α蛋白表达的影响,初步说明该作用也是通过p38MAPK来实现。实验结果显示,随着分化时间的推移,特别是在第8 d,PGC-1α及PPARα的mRNA水平显著上调。免疫印迹结果也证明PGC-1α及PPARα的蛋白表达在第8 d显著增强,第10 d达到较高水平,之后变化不大。同时也检测了心肌特异性基因α-MHC和MLC-2v和肌小节结构蛋白的表达情况,发现PGC-1α及PPARα的表达与α-MHC和MLC-2v的表达时间一致,而在标志心肌成熟的肌小节结构蛋白表达之前。免疫荧光共染色结果显示Troponin-T阳性区域（心肌细胞）PPARα的表达较强,且在分化早期,PPARα较多聚在细胞核。在分化的第5 d至第12 d加入PPARα特异性抑制GW6471能够显著抑制心肌的分化,表现为分化率的降低,α-MHC及MLC-2v基因表达以及α-Actinin及Troponin-T蛋白表达减少,并存在明显的量效关系,然而心肌特异性转录因子（GATA4,Nkx2.5及MEF2C）的表达并无明显改变。另外,PPARα激动剂WY14643能够有效促进心肌的分化。以上结果提示PGC-1α及PPARα在心肌分化过程中有重要作用,作用时间可能在分化早期。当体系中加入10^-7mol/L ICA后,与阴性对照组比,PGC-1α及PPARα在mRNA和蛋白水平表达明显增强,并呈一定量效关系。同时发现,体系中加入ICA后,p38MAPK的磷酸化水平显著上调,特别是在分化的第6 d和第7 d,这与PGC-1α及PPARa的上调时间一致。另外,抑制p38MAPK既能抑制ICA的促分化作用,同时也抑制了ICA所增强的PGC-1α及PPARα蛋白表达。提示ICA的促分化作用可能与其诱导线粒体起源重要调节蛋白PGC-1α及PPARα有关,而该作用也是通过p38MAPK来实现的。以上实验表明:1.在ES细胞体外分化的第5-8 d给予10^-7mol/L ICA,最能有效诱导分化为心肌细胞。2.ROS及其介导的p38MAPK信号通路在ICA促心肌分化过程中发挥重要作用。在EBs向心肌细胞分化过程中,ICA能诱导NOX4表达而使内源性ROS水平升高,ROS通过激活p38MAPK传递信号,活化了的p38MAPK继而促使心肌特异性转录因子MEF2C往核转移,从而增强了心肌特异基因α-MHC和MLC-2v的转录和表达,最终表现为促进了心肌的分化。3.ICA的诱导作用可能与其调节线粒体起源相关蛋白PPARα及PGC-1α表达有关。ICA活化p38MAPK后增强了PGC-1α的表达,进而上调了PPARα的表达。