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生物固氮主要是由钼铁固氮酶催化，固氮酶由钼铁蛋白和铁蛋白两个组分组成。在固氮酶的诸多底物中，生理底物为N<,2>和H<+>。已知N<,2>和H<+>是在固氮酶活性中心FeMo-co上被还原，但其络合和还原的确切位点尚未确定。此外，在固氮酶反应计量式中，每合成一分子氨究竟释放几分子氢气也无定论。在本论文中，通过定点突变棕色固氮菌固氮酶FeMo-co附近关键氨基酸和高柠檬酸，分析突变固氮酶催化N<,2>和H<+>还原能力的变化，就固氮酶FeMo-co上的底物还原位点和电子传递通路两个问题展开讨论，探索固氮酶的催化反应机制。
以棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)为研究对象，利用体外定点突变和染色体基因置换技术，构建Av单突变菌株(α-191)和双突变菌株(α-191/NifV<->和α-195/NifV<->)。对Av和Kp的突变株和野生型菌株分别发酵培养，利用柱层析，凝胶过滤层析和制备电泳纯化其钼铁蛋白和铁蛋白。分析比较野生型和突变株固氮酶对N<,2>、H<+>和C<,2>H<,2>还原活性的变化。
通过分析突变株固氮酶催化底物还原活性特征发现：α-195突变后几乎丧失固氮活性，而对总电子流没有影响；α-191<"Gln>或高柠檬酸发生改变对总电子流影响很大。结合固氮酶三维结构分析，高柠檬酸和α-191<"Gln>可能是电子从P-cluster进入FeMo-co的关键部位，电子可以通过高柠檬酸的长臂进入钼位，nifV发生突变后，高柠檬酸的长臂变短，电子从长臂进入钼位的通路阻断，表现出总电子流下降；α-191<"Gln>在电子传递链上起着枢纽的作用，它和α-195<"His>形成氢键，也可以与高柠檬酸的短臂以氢键相连，从P-cluster传递过来的电子经α-62<"Gys>，α-61<"Gly>到达α-191<"Gln>后在此分流，经仅α-195<"Hia>及α-195<"His>与FeMo-co上S2B的氢键进入N<,2>络合/还原的铁位，也可以通过高柠檬酸的短臂进入钼位。α-195<"His>咪唑基上的ε-N可以与FeMo-co上S2B形成氢键，用于还原N<,2>的电子从α-195<"His进入铁位。
由此本文提出假设：1)，N<,2>可能在FeMo-co靠近S2B的Fe2和Fe6原子上被还原，N<,2>络合到铁原子上形成铁氢化物时置换放氢，此处的放氢反应依赖于<,2>，对CO敏感。钼原子是一个独立的放氢位点，此处的放氢反应受N2非竞争性抑制，对CO不敏感；2)，从P-cluster到FeMo-co之间可能存在两条电子传递通路，其中一条为P-cluster-→α-62→α-61→α-191→α-195，最后通过α-195与S2B形成氢键进Fe2-Fe6上N<,2>还原位点。另一条可能由P-cluster和FeMo-co之间的某个α-螺旋或多个氨基酸残基介导，通过高柠檬酸的长臂进入FeMo-co上的钼原子。