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miRNA-TAS-tasiRNA-target gene级联途径将miRNA和siRNA作用途径联系在一起,在转录和转录后水平调节基因表达,是基因调控网络的重要组分,在植物发育、代谢和胁迫响应过程中起着重要的调节作用。本研究对已获得的桑树sRNA、转录组和降解组数据库分析发现,桑树mul-mi R393可以靶向切割一种生长素信号F-box蛋白基因(MulAFB2)转录本,产生多个以21nt为单位的相变siRNAs(ta-siAFB2s),并通过Northern Blot和定量PCR证明了ta-siAFB2的存在。在此基础上利用PCR和转基因技术研究了桑树MIR393A(MulMIR393A)和MIR393B(MulMIR393B)基因及其靶基因MulAFB2的表达模式和生物学功能,为揭示桑树miR393-AFB2-tasiRNA-target gene级联途径的调控作用奠定了基础,对于促进桑树功能基因组学的研究具有重要意义。本文的主要研究结果如下:(1)桑树miR393-AFB2-tasiRNA级联途径的鉴定利用小RNA靶基因在线分析软件对桑树sRNA、转录组和降解组数据库分析发现,桑树miR393可以靶向MulAFB2转录本,切割其产生多个以21nt为单位的相变的siRNAs,这些siRNAs符合tasiRNAs的特点,是潜在的tasiRNAs。利用Northern Blot和定量PCR技术在桑树中检测到了相关siRNAs的积累,进而证明了桑树中miR393-AFB2-tasiRNA级联途径的存在。(2)MulMIR393A和MulMIR393B基因启动子的克隆及表达特性分析利用PCR技术分别克隆得到Mul MIR393A和MulMIR393B基因的启动子序列pMulMIR393A和pMulMIR393B。两个启动子序列都含有基因正常转录起始必需的顺式作用元件,同时含有不同的环境响应、植物激素和发育调节等多种响应元件。分别构建了由pMulMIR393A和pMulMIR393B启动GUS基因表达的植物表达载体,转入拟南芥植株,利用GUS组织化学染色和GUS荧光定量技术分析了pMulMIR393A和pMulMIR393B的组织表达和诱导表达活性,发现这两个启动子既具有不同的组织表达特异性,又具有不同的植物激素和病原菌诱导表达活性。(3)桑树MulMIR393A和MulMIR393B的生物学功能分析将MulMIR393A和MulMIR393B基因转入拟南芥,通过Northern Blot和定量PCR分析发现MulMIR393A和MulMIR393B基因均能在转基因植株中高效表达,加工产生的5P成熟体可以靶向拟南芥中的AFB2基因。值得注意的是MulMIR393A和Mul MIR393B基因在拟南芥中表达加工生成的5P和3P端成熟体的积累量并不一致,在转MulMIR393A基因植株中5P端成熟体的积累量显著高于3P端成熟体,而转MulMIR393B基因植株中3P端成熟体的积累量则远高于5P端成熟体。表型分析发现转Mul MIR393A和转MulMIR393B拟南芥植株的生长表型有明显不同,并且与野生型相比都有明显差异,表明MulMIR393A和MulMIR393B对植物生长发育有不同的调节功能。对转基因植株分别接种丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000)处理,发现与野生型拟南芥相比,转MulMIR393A拟南芥对Pst DC3000的侵染表现出较强的抗性,而转Mul MIR393B拟南芥则表现出较强的敏感性。因此,MulMIR393A和MulMIR393B基因可能都参与了植物对Pst DC3000侵染的响应过程,但MulMIR393A基因具有正调控作用,而MulMIR393B基因具有负调控作用。(4)桑树miR393靶基因MulAFB2的生物学功能分析根据已有的桑树转录组数据信息设计引物,扩增得到了MulAFB2基因。Mul AFB2cDNA全长为1772 bp,核苷酸序列在不同物种间同源性较高,miR393靶位点区核苷酸序列具有很强的保守性。Mul AFB2 cDNA编码573个氨基酸,编码的氨基酸序列与拟南芥等物种的AFB2蛋白氨基酸序列具有较高的同源性。构建了MulAFB2基因的植物表达载体,转化拟南芥并获得了转基因植株。转MulAFB2植株与野生型拟南芥相比,幼苗根系较短,叶片数较多,对Pst DC3000的抗性降低。因此,MulAFB2不仅与植物的生长发育有关,而且在抗病反应过程中可能起到负调控的作用。