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目的:
在课题组前期对火麻仁油抗衰老作用实验研究与理论研究基础上,初步确认火麻仁油中不饱和脂肪酸、植物甾醇等为有效活性成分。本研究以火麻仁中植物甾醇为目标成分。首先开展从火麻仁油中提取植物甾醇的工艺研究,并建立火麻仁中总甾醇的含量测定方法;研究火麻仁甾醇的体外抗氧化性能及对亚硝酸盐的清除作用,为探究火麻仁甾醇的药理作用机制提供理论和实验依据;观察火麻仁油及火麻仁甾醇对家蚕寿命的影响,测定家蚕血淋巴和小鼠血清中抗氧化指标水平,来反映植物甾醇的抗衰老作用;通过测定家蚕和小鼠的呼吸指标,研究火麻仁油和火麻仁植物甾醇对实验动物能量代谢方面的影响,为探讨“药物影响动物生长与干预动物能量代谢的关系”奠定基础。
方法:
火麻仁中植物甾醇的萃取及含量测定:采用溶剂萃取法从火麻仁油中萃取植物甾醇,以样品量、皂化时间、萃取溶剂用量为考察因素用正交法优选出火麻仁植物甾醇的最佳提取工艺,并用紫外分光光度法测定火麻仁中总植物甾醇的含量;火麻仁甾醇的体外抗氧化能力:用分光光度法测定了火麻仁甾醇对亚硝酸盐(NaNO2)和DPPH*的清除率,以维生素C为阳性对照,评价其抗氧化能力;火麻仁油和植物甾醇对家蚕以及小鼠抗氧化指标的影响:取龄期相同并生长整齐的三眠蚕,随机分为8组,即空白对照组,火麻仁油高、中、低剂量组,火麻仁甾醇高、中、低剂量组,阳性对照组。使用涂抹法将药液涂抹于新鲜桑叶上,4龄期喂食 3次,5龄期内喂食 6次;用火麻仁油及火麻仁植物甾醇对家蚕血淋巴和小鼠血清中 SOD、MDA及GSH-PX的水平进行测定,设立空白对照组、阳性对照组、火麻仁油及甾醇各高、中、低三剂量组;火麻仁油和植物甾醇对家蚕和小鼠能量代谢方面的影响:用呼吸测定仪测定家蚕和小鼠O2、CO2含量的变化,计算呼吸熵,与空白组进行对比。
结果:
正交法优选火麻仁油中植物甾醇最佳提取工艺:通过实验发现样品量,皂化时间和萃取溶剂用量中,样品量有显著影响。从直观分析表确定火麻仁油中植物甾醇的最佳提取工艺是A 2 B 3 C 3,即火麻仁油 50m L ,皂化时间90min,萃取剂乙醚300m L。化学试剂特征显色法和紫外光谱分析均表明提取物为植物甾醇;火麻仁油及植物甾醇对体外清除自由基的测定:对于清除 DPPH*自由基的测定,火麻仁甾醇的清除率最高达到94.13%,IC50(半数清除率)为0.47 mg/mL,维生素C的最高清除率为95.36%,IC50为0.24 mg/mL;对于清除亚硝酸盐的测定,火麻仁甾醇的清除率最高达到85.04%, IC50为0.70mg/mL,维生素C的清除率最高为94.07%,IC50为0.17mg/mL;火麻仁油及植物甾对家蚕寿命和抗氧化指标的影响:火麻仁油及植物甾醇高、中、低剂量组均对家蚕幼虫生存期较空白对照组明显延长( P<0.01或 P<0.05),其中火麻仁甾醇能显著延长家蚕全生存期(P<0.01或P<0.05)。与空白组相比,火麻仁油及甾醇均能显著延长五龄期家蚕耐饥饿时间(P<0.01);火麻仁油及火麻仁甾醇均能显著升高家蚕血淋巴中SOD、GSH的水平(P<0.01),均能显著降低血淋巴中MDA的水平(P<0.01);火麻仁油及植物甾醇对小鼠抗氧化指标的影响:火麻仁油和植物甾醇组中的高剂量组能显著升高SOD的水平(P<0.01),其中油高组并能显著降低血清MDA的水平(P<0.01)。油中剂量组和植物甾醇中、低剂量能降低 MDA的水平(P<0.05);火麻仁油及植物甾醇对家蚕和小鼠能量代谢的影响:火麻仁油组和植物甾醇组的家蚕呼吸熵值均高于空白组(P<0.01),而小鼠的呼吸熵值均低于空白组。家蚕实验中火麻仁油组代谢率高于空白组,而植物甾醇组代谢率低于空白组( P<0.05)。小鼠实验中火麻仁油组和植物甾醇组的代谢率均低于空白组。
结论:
本文得出的正交实验方法可用于火麻仁油中植物甾醇的提取,为接下来药理实验打下奠定基础。火麻仁甾醇对 NaNO2和 DPPH*自由基均有较好地清除作用,火麻仁油及甾醇能提高家蚕和小鼠的抗氧化能力,研究结果提示:火麻仁延缓衰老等作用与增强机体的抗氧化能力、清除体内过氧自由基等有关。火麻仁油及植物甾醇均能够延长家蚕各龄期生存期时间,对家蚕血淋巴中抗氧化指标的水平影响说明药物对延长家蚕寿命影响巨大。同时,火麻仁油及植物甾醇对小鼠血清中抗氧化指标水平的影响以及对实验动物呼吸熵的影响表明火麻仁对机体的能量代谢和物质代谢有广泛影响,与抗衰老等的内在关联性有待进一步深入研究。