配子发生是生殖生物学中的一个基本过程,它依赖于雄性生殖细胞自我更新和分化之间的精确平衡。然而,目前对于调控其平衡的关键因子是知之甚少。amh和dmrt1在哺乳动物性腺发育和雄性性别决定过程中具有十分重要的功能。在本研究中,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别构建了amh和dmrt1基因的斑马鱼突变体,以探究它们在鱼类生殖细胞发育和性别分化中的作用。首先我们发现在amh和dmrt1突变体中均出现了雌鱼比例显著升高的现象,说明amh和dmrt1对于斑马鱼正常的性别分化是至关重要的。在斑马鱼amh突变体中,由于生殖细胞的过度增殖和分化损伤,导致了异常肿大的性腺。组织学分析显示,amh突变的精巢中出现了大量Vasa和PH3标记的细胞,说明amh缺失导致了生殖细胞的大量增殖。用精原细胞标记基因nanos2进行原位杂交实验,进一步确认了这些积累的生殖细胞是精原细胞。而且,统计分析结果表明amh突变的精巢中Sycp3标记的精母细胞数量显著降低,说明amh缺失会使生殖细胞减数分裂受损。免疫荧光结果显示,在amh突变体精巢中仅有少量单个的Insl3标记的间质细胞存在,表明amh缺失会导致精巢间质细胞分化失败。与WT对照相比,突变体精巢中6个精原细胞标记基因和4个支持细胞标记基因的m RNA水平均显著上调,而4个间质细胞标记基因的m RNA水平均显著下调,这与组织学分析的结果是非常一致。amh突变的雌鱼也具有相似的表型,比如膨胀的腹部、肿大的卵巢。组织学分析显示,突变体卵巢中积累了大量处于前期的生殖细胞,卵母细胞成熟停滞在早期阶段、且分化失败。进一步用卵原细胞标记基因nanos2的探针进行原位杂交实验,结果显示amh突变体雌鱼卵巢中卵原细胞的数量异常增多。这些结果说明斑马鱼amh功能缺失也会导致雌性生殖细胞的过度增殖和分化受阻。所以,amh具有维持斑马鱼雌性和雄性生殖细胞正常增殖和分化的功能。相反,dmrt1基因突变会导致精巢退化,呈细线状,没有繁殖能力。组织学结果显示,尽管在早期阶段dmrt1突变体性腺中还存在生殖细胞,但是在43 dpf时,在突变体精巢中已经观察不到Vasa标记的生殖细胞,而且不能形成典型的精巢结构,只有杂乱的体细胞存在。免疫荧光结果表明突变体中这些体细胞大部分为Insl3标记的间质细胞。这表明dmrt1的缺失会损伤斑马鱼雄性生殖细胞的发育和精小叶的形成。进一步研究发现,dmrt1突变的精巢中PH3标记的细胞数量显著减少,同时Sycp3标记的精母细胞也逐渐丢失。而且,与WT相比,突变体精巢中凋亡细胞数量也显著增多,这些凋亡的细胞被鉴定为生殖细胞和支持细胞。因此,这些结果表明dmrt1是斑马鱼早期雄性生殖细胞增殖和维持所必需的。与WT相比,在性腺发育早期阶段,dmrt1突变体精巢中几种生殖细胞标记基因和支持细胞标记基因的m RNA水平均显著下调,直到后期阶段完全检测不到它们的m RNA表达;然而间质细胞标记基因的表达则出现部分上调现象。说明dmrt1在生殖细胞基因和支持细胞基因表达的维持中也有重要作用。而且这些表达变化再次证实了我们的组织学分析的结果:dmrt1突变的精巢中生殖细胞和支持细胞数量逐渐减少,只剩下散乱的间质细胞存在。此外,我们还发现,在dmrt1突变的精巢中,各个时期均不能检测到amh的m RNA表达,同时amh突变的精巢中dmrt1的表达显著上调。与amh突变的雌鱼不同,dmrt1突变的雌鱼卵巢发育正常,具有正常的生殖能力。因此,dmrt1并不影响斑马鱼卵巢的发育。综上所述,我们的研究结果表明:在斑马鱼中,amh抑制精原细胞的过度增殖,促进生殖细胞的分化,以保证增殖和分化间的平衡;而dmrt1则负责雄性生殖细胞的自我更新、增殖及分化;且amh和dmrt1在表达上存在相互反馈调节。因此,amh和dmrt1协同调控斑马鱼雄性生殖细胞的自我更新和分化,保证正常的精巢发育及精子形成。同时,本研究也揭示了amh基因在鱼类中的新功能。