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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)引起的高度传染性疾病,主要表现为呼吸道疾病症状和妊娠母猪繁殖障碍。该病于1996年首次在我国出现,并于2006年大规模爆发,给我国养猪产业造成巨大的经济损失。由于PRRSV具有很强的变异性且可在猪体内持续性感染,使得接种疫苗也无法完全控制PRRS的流行,因此遗传抗性育种是控制该病流行新的研究方向。本研究通过体外模型比较了外来猪品种与我国地方猪品种间PRRSV抗性的差异,检测了部分免疫相关因子在不同品种猪感染PRRSV后的表达,分析了体外感染模型与在体感染模型的关联性;并以APOBEC3F为候选基因,筛选多态性位点,分析其与猪PRRSV易感性的相关性,为猪PRRSV抗性育种和抗性差异形成机制研究提供试验依据。试验内容主要包括以下四部分:1.外来猪种与我国地方猪种PRRSV易感性的比较为研究外来猪种与我国地方猪种间PRRSV抗性差异,本研究采用支气管肺泡灌流法获得长白猪、大白猪、杜长大三元杂交猪、姜曲海猪和定远猪的肺泡巨噬细胞(PAMs),纯化后体外感染PRRSV NJGC珠,分别在感染PRRSV后0h、6h、12h、18 h、2 4h、3 6h收集细胞及培养液上清,同时收集感染后48 h培养液上清。采用荧光定量PCR检测PRRSV在PAM细胞中的载量,同时测定培养液上清PRRSV的病毒滴度。结果表明,PRRSV在不同品种猪PAM细胞中载量随接种时间变化趋势基本相同,在0-6 h缓慢增长,6 h后快速增长并在感染后12 h达到高峰,12 h后开始迅速减少,至感染后36 h病毒载量已经接近感染前水平。不同品种猪PAM细胞培养液上清病毒滴度变化规律略有不同。在0-6 h都快速上升,姜曲海猪和长白猪随后进入平台期并维持在一个较高水平,而大白猪和定远猪持续上升至12h才进入平台期,24 h后都开始下降。对大白猪、长白猪、杜长大三元杂交猪、姜曲海猪和定远猪PRRSV抗性差异比较后显示,姜曲海猪PRRSV抗性最强,定远猪最弱,长白猪、大白猪、三元杂交猪抗性介于两品种之间。表明我国地方猪种PRRSV抗性差异较大,具有很强的选择潜力。2.PRRSV抗性差异品种PAMs中Sn、TLR3、部分细胞因子的表达为进一步探索不同猪品种间PRRSV抗性差异的可能机制,本研究采用荧光定量PCR检测了不同品种猪PAM细胞感染PRRSV前、后不同时间点PRRSV受体Sn、Toll样受体3、白细胞介素IL-8和IL-10、干扰素IFN-γ及肿瘤坏死因子TNF-α的表达。结果发现,PAMs中Sn和TLR3在感染PRRSV后表达量均随感染时间呈上升趋势,并且PRRSV抗性最强的姜曲海猪的表达量均低于其他品种猪,长白猪、大白猪和三元杂交猪表达量均高于定远猪猪种。IL-8在感染PRRSV后表达量开始上升,感染后6 h达到高峰,随后开始持续下降并在感染后12 h低于感染前水平。IL-10在感染PRRSV后表达量也呈上升趋势,在感染后6 h达到高峰并维持至12 h,随后开始下降,至感染后24h又开始上升。并且外来猪种的IL-8、IL-10表达量均高于我国地方品种。IFN-y表达量在感染PRRSV后先呈上升趋势,后逐渐下降至感染前水平。TNF-α的表达量在感染PRRSV先上升随后持续下降。TLR3的表达水平在感染后均呈上升趋势。3.PRRSV感染单核细胞来源巨噬细胞模型与在体感染的关联性研究为探索PRRSV体外感染易感细胞模型与在体感染模型间的关联性,本研究选取PRRSV抗原、抗体检测均为阴性的42日龄杜长大三元杂交猪,分析了外周血单核细胞感染模型与人工在体感染的关联性。通过前腔静脉采集血液并分离纯化获得猪外周血单核细胞(PBMCs),添加GM-CSF刺激其转化成外周血单核细胞来源巨噬细胞(MDMs)后,体外感染PRRSV NJGC并于感染后12 h收集细胞和培养液上清。采用荧光定量PCR检测细胞中PRRSV载量同时测定培养液上清病毒滴度。采血后猪肌肉注射104.47 ICID50 PRRSV NIGC株,每日记录体温、体重并进行综合评分,同时采集感染后0d、1d、3d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d血液并分离血清,检测血清中病毒载量和病毒滴度。结果发现,PRRSV NJGC株感染试验猪后出现典型的PRRS症状,包括食欲下降、嗜睡、体温上升、持续高热、拉稀、咳嗽及不同程度的呼吸困难等,与自然感染猪临床症状相似。血清中PRRSV载量在感染后开始上升并在感染后10 d达到高峰,后开始逐渐下降,至感染后28 d血清中已检测不到PRRSV。血清病毒滴度与PRRSV载量变化趋势基本一致。采用双变量相关分析感染后12 h MDMs中PRRSV载量与不同感染时间血清中PRRSV载量的关联性发现,感染后1d、3d与其呈显著相关,表明体外感染模型与在体感染模型的感染初期有相关性。4.猪APOBEC3F基因单核苷酸多态性与PRRSV易感性的关联分析为探索与猪PRRSV抗性相关的分子标记,本研究选取具有广谱抗逆转录病毒活性的APOBEC3F作为候选基因,对猪APOBEC3F基因外显子3、4、6、7、8和内含子2、3、4、6、7片段进行扩增和测序,筛选多态性位点,分析其与PRRSV易感性的相关性。测序共发现11个突变位点。针对外显子6 g.341 G/A建立CRS-PCR-RFLP方法,仅在姜曲海猪和梅山猪中检测到GG(0.79/0.80)和GA(0.21/0.20)两种基因型;分析341位点与猪PRRSV易感性的相关性,发现GG基因型个体的PRRSV病毒单位拷贝数在接毒后18h显著高于GA基因型个体(P<0.05),表明APOBEC3F基因外显子6与猪对PRRSV抗性相关,外显子6的341位点A等位基因更有利于抵抗PRRSV的感染。针对外显子8 g.5 G/A建立PCR-RFLP方法,检测9个猪种群共193个样本,发现在定远猪和梅山猪中有GG(0.50/0.60)、GA(0.33/0.20)和AA(0.17/0.20)三种基因型,在二花脸猪中仅有GG(0.60)和GA(0.40)两种基因型,其他群体均为GG型。AA基因型猪肺泡巨噬细胞中PRRSV拷贝数在接毒后12 h显著高于GG基因型(P<0.05),极显著高于GA基因型(P<0.01)。表明APOBEC3F基因外显子8与PRRSV抗性相关,5位点G等位基因更有利于抵抗PRRSV的感染。这为进一步探讨APOBEC3F基因作为PRRSV抗性猪辅助选育标记提供了试验依据。