家蚕高效富集1-脱氧野尻霉素机理初步研究

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桑叶中1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)是一种高效的糖苷酶抑制剂,能有效抑制二糖的分解,使单糖在肠道吸收降低,从而抑制血糖升高。家蚕一生食桑,且对DNJ具有奇妙的富集作用,但是关于家蚕富集DNJ的机理和过程目前国内外尚未明确揭示。本论文研究了家蚕蚕体DNJ富集与食桑量的相关性及家蚕体内DNJ含量与二糖酶的关系,并采用蛋白质双向电泳、差减杂交技术、RT-PCR等分子生物学方法和技术手段初步研究家蚕体富集DNJ的分子机制。主要研究内容和结论如下:   (1)家蚕1-脱氧野尻霉素体内富集分布规律及与食桑量的相关性研究。采用了柱前衍生化高效液相色谱法分析不同生长阶段家蚕及其代谢产物和所食桑叶中DNJ的含量,研究家蚕体1-脱氧野尻霉素富集与食桑量的相关性,结果显示不同组织器官中蚕血DNJ含量最高,达0.4%,其次为蚕消化管,丝腺中未检测到。不同生长期家蚕及其副产物中DNJ的累积量有较大差异,且呈一定规律性变化,先上升后下降,于四龄时最高。家蚕幼虫期蚕体及其副产物中DNJ总累积量与其在该阶段所食桑叶中DNJ总量相当,且家蚕的任一成长发育阶段(蚁蚕和熟蚕不吃桑叶除外),其蚕体DNJ含量均大大高于桑叶中的DNJ含量,表明家蚕具有累积或富集DNJ的机能,本研究结果为进一步研究家蚕富集DNJ的机制提供了理论依据。   (2)初步研究了家蚕体内DNJ含量与二糖酶的关系。采用芴甲氧酰氯(FMOC-Cl)柱前荧光衍生.高效液相色谱法测定了25个品种家蚕五龄第三天蚕体DNJ含量,并采用还原糖法测定不同家蚕体内的糖苷酶活力。结果表明,不同品种家蚕体DNJ含量差异较大,最高的品种与最低的品种含量相差6.91倍;家蚕体DNJ含量与蚕体内的蔗糖酶、乳糖酶等二糖酶活力呈负相关,与淀粉酶的活力相关性较小。   (3)初步鉴定了家蚕富集DNJ的糖苷酶抑制性的相关特异蛋白。采用蛋白双向电泳及质谱分析技术对家蚕富集DNJ的相关酶物质进行探索性研究,鉴定出囊泡的ATP合酶催化亚组A,热休克同源蛋白,actinA3,谷胱甘肽硫转移酶,质子转移ATP合酶β亚基,丝氨酸蛋白酶前体,血淋巴蛋白,果糖1,6-二磷酸盐(酯)缩醛酶,硫醇蛋白等在内的9个特异蛋白,且推测与DNJ富集相关。   (4)家蚕富集DNJ的二糖酶抑制性相关基因SSH文库的构建。建立了家蚕体DNJ含量差异较大的组织间抑制性消减杂交cDNA文库,从建立的cDNA文库随机挑选出40个阳性克隆进行测序,通过BLAST比对,得出细菌核糖体RNA、碱性丝氨酸蛋白酶、核糖体蛋白、16s核糖体RNA、类胰蛋白酶、表皮甘氨酸蛋白、过氧化氢酶和碱性核酸酶等8种蛋白,对消减文库中的差异表达基因进行半定量RT-PCR分析,研究推测碱性丝氨酸蛋白酶和过氧化氢酶可能与DNJ富集相关。
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