产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coil,ETEC)是导致动物腹泻的主要致病菌之一,该病常发生于幼龄动物,严重威胁畜牧养殖业的健康发展。ETEC可产生一种或几种肠毒素,其产生的耐热肠毒素为主要致病因素。近年来,由于治疗腹泻的药物价格不断提升及主要致病菌中耐药菌株的不断出现,使得通过新型微生态制剂对腹泻进行免疫预防成为当前研究的热点。酵母菌是人和动物重要的益生菌,它含有对机体有益的多种营养物质及生长因子,在增强动物生产性能的同时,促进肠道黏膜的发育并加强免疫功能,改善肠道菌群,且酵母菌是真核生物,其内的各种细胞器和多种酶能够作用于翻译后的蛋白修饰,基于此建立起来的酵母菌表面展示技术能够将基因的多样性通过正确折叠的蛋白准确表达出来。该技术可展示的蛋白种类多、分子数量大,且在筛选、纯化、活性测定等方面操作简便。目前,酵母菌表面展示技术已应用于多个研究领域,应用前景广阔。本研究旨在将大肠杆菌的耐热肠毒素(ST)融合蛋白展示在酿酒酵母菌表面,获得ST酵母基因工程菌,并探究其对大鼠肠道菌群、小肠黏膜结构及黏膜免疫的影响。为研发具有特异性免疫功能的微生态制剂奠定基础。主要研究内容和结果如下:1、应用表面展示技术构建ST酵母基因工程菌。利用Overlap PCR方法,将定点突变后的estA基因与estB基因连接,将融合基因片段连接至表面展示质粒pYD1中,构建表面展示质粒pYD1-estA-estB,将其电击转化至EBY100酿酒酵母菌中,筛选获得ST酵母基因工程菌,通过免疫荧光检测,证明ST融合蛋白成功展示在酿酒酵母菌表面。2、ST酵母基因工程菌对大鼠肠道菌群的影响。选取4-6周龄的SPF级SD大鼠90只,雌雄各半。随机分为空白对照组、工程菌组及酵母菌组,对各组分别灌服生理盐水、107 cfu/mL工程菌菌液、107 cfu/mL酿酒酵母菌菌液2mL/只,每日一次,持续灌服21天,再连续3天对每组大鼠灌服108 cfu/mL的大肠杆菌H10407菌液5mL/只,在灌服的第7、14、21天及攻毒3天后取所需的粪便样本,利用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)、实时荧光定量PCR(Real-time PCR),研究酵母基因工程菌对肠道菌群OTU(微生物可操作单元)和肠道内5种标志性细菌:类杆菌(Bacteroides)、梭菌(Clostridium)、肠球菌(Enterococcus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)数量的影响,并测量肠道pH值。结果显示在灌服期间,工程菌组及酵母菌组的OTU值、各细菌数量均不同程度的高于空白对照组,pH值均明显低于空白对照组。攻毒后,工程菌组的OTU值、类杆菌、乳杆菌、双歧杆菌数量极显著高于其他两组(P<0.01),工程菌组的pH值与灌服前无显著差异(P>0.05)。结果表明ST酵母基因工程菌能丰富肠道菌群多态性,增加肠道内重要细菌数量,降低肠道酸碱度。当攻毒后,工程菌能有效降低ETEC对肠道菌群及重要细菌的影响,维持肠道pH值稳定。3、ST酵母基因工程菌对大鼠小肠绒毛结构的影响。采集大鼠的十二指肠、空肠、回肠组织制作切片,测量并统计分析各组大鼠的十二指肠、空肠、回肠绒毛长度、宽度、隐窝深度、绒毛长度/隐窝深度(V/C)的变化。结果表明,与空白对照组相比,工程菌组及酵母菌组的各段肠绒毛长度及V/C值有明显升高。灌胃大肠杆菌后,与工程菌组相比,空白对照组及酵母菌组的十二指肠与空肠绒毛长度、V/C值均不同程度降低;空肠隐窝深度极显著升高(P<0.01);回肠V/C值极显著下降(P<0.01)。由此表明工程菌促进小肠绒毛的发育,加强肠道黏膜的吸收功能,有效抵御ETEC对小肠绒毛结构的损伤。4、ST酵母基因工程菌对大鼠肠道黏膜免疫的影响。利用ELISA、Real-time PCR技术研究肠道黏膜中的分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)及血清中免疫球蛋白G(IgG)含量变化,并对大鼠血清学指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血糖(GLU)、胆固醇(CHO)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)含量进行测定。由检测结果得出在前21天灌胃期间,工程菌组与酵母菌组sIgA、细胞因子水平均高于空白对照组,血清学指标无明显差异,工程菌组血清中IgG效价在第21天达到1:320。在攻毒ETEC后,工程菌组各项数据变化幅度最小,表明ST酵母基因工程菌能提高动物肠道黏膜免疫力,促进细胞因子的分泌,刺激机体产生免疫反应,对动物机体安全、无毒,且能降低ETEC对黏膜免疫力影响。综上所述,本研究成功构建展示大肠杆菌ST的酿酒酵母基因工程菌,试验结果证明,该工程菌不仅具有良好的益生作用,提高肠道黏膜免疫力,而且能有效预防及保护由ETEC引起的动物肠道菌群失调及小肠黏膜结构损伤。