RNA干扰抑制HMGB1基因表达对子宫内膜癌细胞增殖作用的研究

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目的:通过RNA干扰抑制子宫内膜癌细胞中高迁移率族蛋白1(High mobility group box1, HMGB1)的表达,研究HMGB1对子宫内膜癌细胞的增殖及细胞周期、细胞凋亡的影响,并探讨其分子机制。方法:构建靶向HMGB1基因的慢病毒shRNA载体,转染子宫内膜癌细胞株HEC-1A,同时利用实时荧光定量聚合酶链反应法(Real time-PCR)和免疫印迹法(Western Blot)检测转染HMGB1-siRNA后细胞HMGB1mRNA和蛋白表达水平的变化。MTT法和流式细胞术分别检测转染HMGB1-siRNA后HEC-1A细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的变化。Western Blot法检测转染HMGB1-siRNA后细胞AKT、pAKT和CyclinD1蛋白的表达水平。结果:1、子宫内膜癌细胞株HEC-1A转染慢病毒重组质粒后,荧光显微镜下可见细胞表达较强的荧光信号,转染效率达80%左右,说明转染成功。2、子宫内膜癌细胞转染慢病毒72h后,Real time-PCR结果显示:实验组细胞中HMGB1mRNA表达较空白对照组和阴性对照组降低(P<0.05); Western Blot检测细胞中HMGB1蛋白表达显示:实验组明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01)。3、MTT检测结果显示:实验组细胞增殖率约为72.03%,较空白对照组和阴性对照组显著降低(P<0.01);流式细胞术检测细胞周期分布结果显示:实验组G0/G1期细胞比例较空白对照组和阴性对照组明显增加(P<0.01),而实验组S期和G2/M期细胞比例均显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01)。4、Annexin V-FITC&PI双染法检测细胞凋亡情况显示:实验组早期凋亡率、中晚期细胞凋亡率以及细胞总凋亡率均高于空白对照组和阴性对照组(P<0.01)。5、三组细胞中AKT蛋白表达无明显差异(P>0.05),而实验组细胞中pAKT和CyclinD1蛋白表达水平均较空白对照组和阴性对照组降低(P<0.01)。结论:慢病毒介导的HMGB1shRNA重组质粒可有效抑制子宫内膜癌细胞中HMGB1mRNA和蛋白的表达;沉默子宫内膜癌细胞中HMGB1基因表达,可抑制细胞增殖,且使细胞周期阻滞于G0/G1期,并诱导细胞凋亡;在子宫内膜癌中,HMGB1可能通过PI3K/AKT信号通路影响细胞增殖过程。
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