众所周知,糖尿病(Diabetic mellitus, DM)已成为21世纪世界范围内的一种流行病。它是继肿瘤、血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病,具有高致死率、高致残率和高医疗花费的特征,成为当前世界各国共同面对的公共健康问题。DM在中国的严峻形势更是发人深省。在最新一期国际著名医学期刊《新英格兰医学杂志》上,一篇名为“中国人群中的DM患病率”的研究论文公布了最近调查结果：中国DM患者人数达9200万,数量达到世界第一。其增长速度令人震惊。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是DM患者最常见、最严重的全身性微血管并发症之一。在欧美国家DN占终末期肾脏病(end stage renar disease,ESRD)透析病人第一位的病因,而在我国,DN虽不是ESRD的首要病因,但每年以高速率递增。DN是肾脏疾病中治疗最为困难、发展速度快、预后差,进展成ESRD医疗费用高的严重危害人民健康的继发性肾小球疾病。因此,明确DN的发病机制及治疗方法成为了当前临床医学领域中首当其冲要解决的问题。既往研究认为,DN的主要病理特征是细胞外基质的堆积、系膜增宽、基底膜增厚,肾小球硬化及肾间质纤维化。然而这些因素仅能解释30%—50%的尿蛋白排泄率和肾小球滤过率的变化。DN的发病机制仍未完全明确。近年来,随着对肾小球滤过屏障结构和功能改变的研究,尤其是对肾小球滤过屏障结构成分的足细胞在DN的发生发展中的作用,成为研究热点。目前已经证实足细胞的异常改变是DN的主要病理学改变,并和其相关蛋白的改变一起在DN的发病中起到关键性作用。足突细胞裂孔隔膜(slitdiaphragm,SD)是肾小球滤过屏障的重要组成成分,起到“静态分子筛”的作用,同时它又是高度“动态”的功能复合体,参与了对维系足细胞正常生物学所必须的信号传导的发生与传递和细胞骨架的组成。CD2AP (CD2-associated protein)是构成其信号传导的主要分子,主要与podocin和nephrin以蛋白复合体的形式存在。CD2AP基因敲除的小鼠可发生先天性肾综。研究发现,其还可能与actin相互结合,将nephrin锚定在actin细胞骨架上的作用。ZO-1 (zonula occudens-1)是细胞骨架接头蛋白之一,能将SD相关蛋白连接到细胞骨架上,对维持足突细胞的完整性有重要的作用。近期研究发现,它又能与SD组成蛋白之一的NEPH1(足细胞的一种组成蛋白)相结合,诱导其信号传导。而CD2AP在蛋白复合体中是否通过作为NEPH1的同源分子nephrin(足细胞的一种主要的组成蛋白)与ZO-1有联系作用,且在DN病变过程中,ZO-1表达的变化以及它与足细胞数目减少的关系至今还未完全阐明。目前西医治疗DN主要是控制高血糖、减少蛋白尿、控制高血压、低蛋白饮食及纠正脂代谢紊乱等对症治疗。近年来研究发现血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)类药物及血管紧张素Ⅱ(Angiotenin II, Ang II)受体拮抗剂能减少蛋白尿,具有一定程度保护DN肾脏的作用,但它们也不能完全阻断DN进展。而中医方面在延缓DN病情的进展和肾衰竭方面显示出良好的效果,但DN临床分型无统一标准和量化指标,涉及方药很多,且有一些自拟方,药物加减变化较大,疗效标准不统一,限制了其推广应用。目前DN缺乏有效的药物治疗,至今尚没有一个能完全阻止DN进展的药物。中医药从CD2AP和ZO-1方面的研究未见报道。因此,积极探求DN的治疗与CD2AP、ZO-1的关系具有重要意义。第一章肾康丸对DN大鼠肾脏的保护作用以及对肾组织CD2AP、ZO-1的影响[目的]探讨肾康丸对DN大鼠模型的肾脏保护作用以及对CD2AP和ZO-1表达的影响,为进一步研究药物作用机制提供实验依据。[方法]1.DN大鼠模型的制备：首先用链脲佐菌素(STZ)以55 mg·kg-1大鼠体重左下腹腔内一次性注射制作DM大鼠模型。连续喂养2w,测血糖、尿量,若血糖值>16.6mmol·L-1、尿量>原尿量150%、尿蛋白排泄>30mg·kg·/24h-1以上,则造模成功。2.分组和给药：大鼠造模成功后,称重,随机分为4组：模型对照组,美卡素组和肾康丸组,另设正常对照组。肾康丸组大鼠实验用量设定为1.1g·kg-1大鼠体重,肾康丸研磨后用蒸馏水配成0.22g·mL-1混悬液。美卡素片组大鼠实验用量设定为7.2mg·mg-1大鼠体重,美卡素片研磨后用蒸馏水配成2.9mg·mL-1溶液。模型对照和正常对照组大鼠灌服等容积生理盐水。分别灌服相应药物浓度的混悬液,每日1次,连续8w。各组大鼠自由进食饮水,实验中不予任何降血糖药物。3.疗效观察与检测：①一般情况的影响：活动、精神状态、毛发、摄食量、饮水量、大小便、体重。②对大鼠肾重、相对肾重的影响。③对大鼠血脂(生化法)、尿肌酐(苦味酸法)、血糖(血糖仪)、糖化血红蛋白(紫外分光光度法)、24h尿蛋白总量(考马斯亮兰法)的影响。④对大鼠肾组织病理的影响(光镜、透射电镜观察)。4.免疫组化法研究CD2AP和ZO-1在正常大鼠和DN大鼠肾脏组织的分布和表达情况。[结果]1.46只大鼠用于造模,成模率78.9%(30/38),成模后病死率4.67%(2/30)。2.8周治疗期间,模型组大鼠血糖均维持在16.7mmol·L-1以上,尿糖+++以上,表现出多饮、多食、多尿、消瘦的DM症状,肾康丸、美卡素治疗组大鼠一般情况均较模型对照有所改善。3.正常对照组及各治疗组大鼠体重均较治疗前增加(P<0.05或P<0.01)；与模型对照组相比较,肾康丸组与美卡素组增长量显著增加(P<0.01,P<0.05)。4.与正常对照组比较,各组大鼠血糖、GHb.24hUpro、Scr、BUN、TC、TG、LDL-c均升高(P<0.01),24h尿量及饮水量增加(P<0.01)；与模型对照组比较,肾康丸、美卡素治疗均可以降低24hUpro、Scr、BUN及24h尿量及饮水量(P<0.01或P<0.05)；肾康丸治疗可以降低血糖、GHb (P<0.05)。各组中,仅肾康丸组TC、TG. LDL-c显著下降(P<0.01)。5.与正常对照组比较,各组大鼠HDL-c显著降低(P<0.01)；与模型对照组相比,肾康丸治疗组对HDL-c具有显著升高作用(P<0.01)。6.与正常对照组比较,模型组大鼠肾重及相对肾重增加(P<0.01),且出现了相当于Mogensen分期的3期左右DN病理损害。肾康丸、美卡素病理改变较模型组均有不同程度的减轻,其中肾康丸组效果更为显著。7.免疫组化法观察正常大鼠肾组织中CD2AP主要表达于肾小球足细胞内,在肾小管,集合管也有少量表达。而ZO-1主要沿着肾小球毛细血管袢呈点状分布。与正常组相比,模型对照组中CD2AP及ZO-1表达明显下降,而治疗组其表达逐步恢复正常。其中,肾康丸组CD2AP及ZO-1表达量与正常组无明显差别。[结论]1.肾康丸能够改善实验性DN大鼠一般状态,具有一定的调节血糖、血脂代谢的作用。2.肾康丸能够降低实验性DN大鼠尿蛋白,降低血清BUN及Scr水平,具有一定的保护肾功能作用。3.肾康丸能够改善DN大鼠肾脏组织病理学改变,缓解肾脏病理损伤。4.肾康丸能上调CD2AP及ZO-1在DN肾脏组织中的含量,且抑制其易位。第二章肾康丸对高糖刺激的大鼠肾小球足细胞CD2APmRNA表达的影响[目的]探讨肾康丸对高糖刺激下的大鼠肾小球足细胞(podocyte, PC) CD2APmRNA表达的影响。[方法]1.含药血清的制备：雄性SPF级SD大鼠25只,适应性喂养一周后随机分为5组,分别灌服相应药物浓度的肾康丸(高、中、低剂量)和美卡素混悬液及等容积生理盐水制作肾康丸高、中、低剂量含药血清,美卡素含药血清和正常血清。2.PC培养分组、干预及活力测试：由广东省人民医院惠赠,取生长状态好的已分化的足细胞随机分为7组：正常糖组、高糖刺激组、高糖刺激加正常血清组、肾康丸高、中、低剂量组,美卡素组,每组5孔,以相应的试剂及药物血清干预24小时和48h后,进行细胞活力检测。3.根据活力检测的结果选择效价最高的肾康丸含药血清组进行PC细胞的培养,再次选取一批生长状态好的已分化的PC细胞,并将其分为5组：正常糖组、高糖刺激组、高糖刺激加正常血清组、肾康丸组和美卡素组,每组设6孔。研究其对DN大鼠肾小球足细胞CD2APmRNA表达的影响。4. RT-PCR法检测足细胞中CD2APmRNA表达：Trizol法提取和纯化PC总RNA,以0.1% DEPC处理水50μl溶解后分装,加RNAin保存于-70℃冰箱。设计CD2AP及内参GAPDH引物序列,取总RNA2μl进行逆转录,逆转录反应依照Promega公司提供的逆转录系统试剂盒说明书进行。内参照采用GAPDH,检测PC中CD2APmRNA的表达。5.用Western blot法检测足细胞CD2AP的含量。[结果]1.48h内,肾康丸中剂量较其他剂量对高糖刺激下的足细胞损害的缓解效力最好。2.与正常组比较,模型组大鼠肾脏CD2AP mRNA表达量减少(P<0.05)；与模型组比较,肾康丸组、美卡素组均可上调CD2AP mRNA的表达,但以肾康丸组上调显著(P<0.01),且与正常组相比,无统计学意义(P>0.05)。3.用Western blot法观察到高糖组和正常血清组中CD2AP蛋白表达明显低于正常糖组,而肾康丸组和美卡素组则稍略低于正常糖组,但与高糖和正常血清组相比则明显增多。[结论]肾康丸可以上调高糖刺激下的PC中CD2APmRNA及蛋白表达。第三章肾康丸对高糖刺激的大鼠肾小球足细胞ZO-1mRNA表达的影响[目的]探讨肾康丸对高糖刺激下的PC中ZO-1mRNA表达的影响。[方法]同上。[结果]1.与正常组比较,模型组大鼠肾脏ZO-1mRNA表达量减少(P<0.05)：与模型组比较,肾康丸组、.美卡素组均可上调ZO-1mRNA的表达,但以肾康丸组上调显著,与高糖组及正常血清组相比有显著性差异(P<0.01),且与正常组相比,无统计学意义(P>0.05)。2.用Western blot法观察到高糖组和正常血清组中ZO-1mRNA蛋白表达明显低于正常糖组,而肾康丸组和美卡素组则稍略低于正常糖组,但与高糖和正常血清组相比则明显增多。[结论]肾康丸可以上调高糖刺激下的PC中ZO-1mRNA及蛋白表达。全文结论：本研究通过DN动物模型实验研究,再次证明肾康丸具有治疗DN和保护肾脏的作用；通过观察肾康丸对DN大鼠及体外高糖培养的PC细胞中CD2AP和ZO-1mRNA的表达情况,提示其可上调CD2AP和ZO-1的表达,从而能维持肾小球足细胞结构的完整性,为肾康丸治疗DN提供了分子水平的实验依据。