论文部分内容阅读
目的：构建能表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)或荧光素酶(1uciferase，Luc)的重组B组柯萨奇病毒株3型(coxsackievirus B3，CVB3)，以实现定量检测CVB3感染。
方法: 分别将加强型绿色荧光蛋白基因(enhancedGFP，eGFP)和Luc基因克隆至CVB3基因组开放读码框起始位置，将重组病毒基因组DNA转染HeLa细胞以恢复病毒，测序，评价重组病毒的eGFP、Luc表达，扩增重组病毒并测定重组病毒株毒力。
结果:
①成功构建5个重组病毒质粒，转染HeLa细胞，pCVB3—eGFP转染细胞可见eGFP表达和细胞病变：表达海肾荧光素酶(humanized form of Renilla Luc，hRLuc)、荧火虫荧光素酶(fireflyluciferasc，Luc)及其变异体的pCVB3—hRLuc、pCVB3—Luc和pCVB3—Luc2转染后第1代均可检测到hRLHc和Luc活性，但只pCVB3—hRLuc转染细胞有明显细胞病变；hRLuc和Luc双表达的pCVB3-d5’—dL转染细胞只能检测到hRZuc活性而未能检测到Luc活性，无细胞病变可见；
②扩增和纯化的CVB3—eGFP和CVB3—hRLuc病毒感染HeLa细胞可见明显细胞病变、绿色荧光或hR—Luc活性。扩增CVB3—Luc和CVB3—Luc2的过程中没有观察到明显的细胞病变，且从第2代病毒开始就未能检测到荧光素酶活性；
③用HeLa细胞经空斑形成试验进行毒力测定，CVB3—eGFP和CVB3—hRLuc的毒力分别为1.17×100 pfu/mL和1.4×107pfu/mL。
结论: 成功构建了表达eGFP、hRLuc的重组CVB3毒株CVB3—eGFP和CVB3h—RLUC，为定量研究CVB3感染打下基础。