Saponins PD,为五坏三帖皂苷类化合物,存在于白头翁(Pulsatilla chinensis)、洋常春藤(Hedera helix)、黑种草(Nigella sativa)、黄褐毛忍冬(Lonicera fulvotomentosa)等多种植物中,现代药理研究表明,Saponins PD具有抗肿瘤、抗炎、保肝、抗利什曼原虫等药理活性。其抗肿瘤活性越来越多的受到国内外学者的关注。课题组前期预试验发现Saponins PD具有明显抗肿瘤作用,但其口服生物利用度极低(<1%)。基于目前有关Saponins PD的研究多集中在其含量测定、药理及生物活性研究等方面,本课题组以开发Saponins PD抗肿瘤新药为目的,探索其口服生物利用度低的原因,对Saponins PD的提取分离、吸收、药代动力学、体内药物代谢等进行了系统的研究,为进一步开发研究Saponins PD提供科学依据。本文主要研究内容分如下几部分：第一部分Saponins PD的提取分离及鉴定为了获得稳定可靠的提取分离工艺及质量可靠的原料,本文对Saponins PD的提取分离工艺进行了研究,采用硅胶柱层析及重结晶的方法进行Saponins PD的分离制备,再运用核磁波谱技术和HPLC法进行结构的确证和含量测定,得到含量达98%以上的Saponins PD,为后续理化性质、药理活性、药物体内过程评价的研究提供物质保障。第二部分Saponins PD抗肿瘤活性研究为了对Saponins PD的抗肿瘤活性进行筛选,采用MTT法测定了Saponins PD对10种肿瘤细胞的生长抑制活性,结果表明,Saponins PD对10种肿瘤细胞均有一定的抑制作用,与文献报道一致。利用小鼠H22荷瘤、S180荷瘤、Lewis荷瘤实验,初步分析了Saponins PD对小鼠的肿瘤抑制情况。结果表明,灌胃给药高、中、低剂量Saponins PD对H22荷瘤的抑瘤率均达40%以上；高、中剂量对S180荷瘤的抑瘤率达40%以上；高、低剂量对Lewis荷瘤的抑瘤率达40%以上,说明对三种荷瘤均具有一定的抑制作用。腹腔注射高、中、低剂量Saponins PD对Lewis荷瘤有明显的抑制作用抑瘤率分别为72.9%、70.5%、47.7%,与阳性药物顺铂的抑瘤率相当。实验还考察了能够反映机体免疫功能状态的脾脏和胸腺脏器指数以及能反映机体骨髓造血功能的血细胞计数指标,结果表明：Saponins PD在抑制肿瘤的同时对机体免疫系.统影响不大,不会造成类似环磷酰胺那么显著的免疫抑制,对机体骨髓造血功能无明显抑制作用。第三部分Saponins PD理化性质研究Saponins PD的主要理化性质是影响其药效及制剂设计的关键因素,本文采用HPLC法对Saponins PD在常温下的长期稳定性、平衡溶解度和表观油水分配系数进行了测定。采用摇瓶法进行平衡溶解度及表观油水分配系数实验,用高效液相色谱法测定SaponinsPD在水、有机溶剂和缓冲液中的质量浓度。结果显示：常温常压下放置,Saponins PD在16个月内稳定；在水中的平衡溶解度为0.01mg·mL-1,在有机溶剂正丁醇中的溶解性最好,为86.10mg·mL-1;在正辛醇-水中的表观油水分配系数为24.73(logP=1.39),SaponinsPD的油水分配系数在适宜的范围内,但是其水溶性很差,可能会影响Saponins PD的吸收。第四部分Saponins PD及Saponins PD钠盐的在体肠吸收研究大鼠在体肠单向灌流模型是目前研究药物吸收机制应用最多,国际上公认的、经典的、成熟的模型和工具。为进一步探讨SaponinsPD的溶解性对吸收的影响,本节实验对Saponins PD及其钠盐的肠吸收机制进行研究。采用大鼠在体肠单向灌流模型进行实验,利用HPLC法对药物的质量浓度进行检测,考察不同肠段、药物不同质量浓度、药液不同pH、肠道菌群以及P-gp抑制剂对药物吸收的影响。结果表明,Saponins PD在不同肠段的吸收速率常数Ka大小顺序为回肠>结肠>空肠>十二指肠；Saponins PD在碱性环境下吸收较好：在肠道的吸收机制可能为被动扩散；肠道菌群对Saponins PD吸收有显著性影响；Saponins PD不是P-gp底物。对Saponins PD钠盐在不同肠段和不同质量浓度下进行在体肠吸收实验的结果表明,Saponins PD钠盐在不同肠段均有吸收,其吸收速率常数K。大小顺序是空肠>十二指肠>回肠>结肠。Saponins PD钠盐不同浓度下在大鼠空肠的吸收参数没有显著性差异,提示Saponins PD钠盐在小肠的吸收没有浓度依赖性,吸收机制可能为被动扩散。上述研究揭示,Saponins PD肠道吸收较差,制成钠盐后,吸收有所增加,主要吸收部位发生改变,说明药物的溶解性对吸收有影响。同时,通过实验推测化合物本身的水溶性差及肠道菌群的代谢可能是导致其吸收差的重要原因。第五部分Saponins PD、Saponins PD钠盐、Saponins PD环糊精包合物大鼠体内药代动力学研究药物动力学研究对于药物生物利用度、疗效、毒性的评价及由此延伸出的药物剂型设计等方面具有十分重要的作用。为了深入了解Saponins PD在大鼠体内吸收情况以及Saponins PD的药理活性机制,本文对大鼠灌胃和静脉给药Saponins PD、灌胃给药SaponinsPD钠盐和Saponins PD环糊精包合物后在大鼠体内的药代动力学进行全面的考察和研究。首先建立了生物样品中检测Saponins PD的HPLC-MS/MS方法,检测了大鼠血浆中的药物浓度,并进行了药代动力学参数的计算。结果表明,Saponins PD、Saponins PD环糊精包合物、Saponins PD钠盐在大鼠体内的吸收非常慢,吸收总量小,口服生物利用度极低,Saponins PD制成钠盐后口服生物利用度有所提高,说明增加其在水中的溶解度,有利于吸收。第六部分Saponins PD、Saponins PD钠盐、Saponins PD环糊精包合物大鼠体内组织分布研究基于前述体内吸收实验推测,Saponins PD可能与某些组织有特殊结合,为了探索药物进入生物体内在各组织中的分布情况,以及不同的制剂是否会影响体内药物的分布。本文采用HPLC-MS/MS法分别对灌胃Saponins PD、Saponins PD钠盐、Saponins PD环糊精包合物后,大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、脂肪中药物的浓度进行检测。结果显示,在检测的8个组织中均有分布,SaponinsPD、Saponins PD钠盐、Saponins PD环糊精包合物的分布趋势基本一致,对肝、肺有一定的靶向性。第七部分Saponins PD大鼠体内排泄研究在药代动力学实验研究中,发现Saponins PD的生物利用度极低,为了寻找生物利用度低的原因,本文采用HPLC-MS/MS法测定大鼠灌胃给予Saponins PD后,不同时间段尿液和粪便中Saponins PD的浓度。结果表明,大鼠灌胃给予Saponins PD后,72h内在尿和粪中的累积总排泄率达77.03%,说明主要以原型药物排泄。第八部分Saponins PD在大鼠体内的代谢研究Saponins PD药代动力学实验研究表明,其口服生物利用度极低(<1%)。但前期抗肿瘤活性实验中,其口服仍能表现出良好的抗肿瘤活性,推测可能某些代谢物具有较强的抗肿瘤活性；另对Saponins PD灌胃后大鼠粪便和尿液的排泄研究发现,其在尿和粪中的总排泄率为77.03%,主要以原型排泄,但有22.97%的Saponins PD则去向不明,可能以代谢物的形式排泄。本文采用UHPLC-TripleTOF-MS/MS对大鼠在体肠孵育样品及灌胃给药后胆汁、尿液、粪便和血液样品进行了分析,推测了Saponins PD在大鼠体内的代谢产物。经分析得到各代谢物的二级质谱图,通过与原型药物的二级质谱图及质谱裂解规律进行比较,结合Peak View软件进行分子式的拟合,共推测鉴定了除原型药物及其同分异构体外的26个代谢产物,其中包括了一些代谢物的同分异构体。从代谢物的结构来看,原型药物在体内主要发生了氧化、还原和结合反应。本文对Saponins PD的提取分离、抗肿瘤活性、理化性质、在体肠吸收、大鼠体内药代动力学及体内代谢产物进行了系统研究,得到了分离Saponins PD的稳定可靠的工艺路线,阐明了Saponins PD的溶解特性,Saponins PD在体肠吸收的方式以及其在大鼠体内的吸收、分布、代谢、排泄的规律,为Saponins PD的进一步研究提供了科学依据。