白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎,具有健脾益气,燥湿利水,止汗,安胎的功效。传统理论认为,白术生品具有一定的燥性,经麸炒后,可降低辛燥之性,增强其健脾燥湿,导滞止泻的作用。中药炮制是个复杂变化的过程,目前认为麸炒白术的炮制原理主要为“减酮增酯”,且研究主要集中在炮制前后药物化学成分的变化,对炮制整个过程中物质基础和药效作用的变化,及辅料蜜麸在炮制过程中发挥的关键作用少有研究,课题组前期对白术在麸炒过程中白术内酯及多糖的含量变化进行了研究,为了进一步揭示白术麸炒炮制原理,找到辅料蜜麸在白术麸炒过程中发挥的实质性作用,本课题对白术麸炒过程中糖类成分、挥发性成分、无机元素及药效作用的变化进行比较,首次对白术整个麸炒过程中的化学成分和药理作用两方面进行研究,以期阐明麸炒炮制科学内涵,建立麸炒白术最佳炮制点(药效最好、副作用最小)的客观、快速判别方法。具体研究内容如下:1白术炮制样品制备白术炮制品由四川新荷花中药饮片公司依据《中国药典》2015年版(0213炮制通则)项下麸炒炮制方法进行炮制。炮制过程中于不同时间点取样,得到不同炮制时间点白术样品。本研究共炮制3批麸炒白术样品,批号分别为141010-1、141010-2、160718-1,2批清炒白术样品,批号分别为141010-3、160718-2。白术的整个炮制过程可分为炒轻(炮制时间4~8min)、炒黄(8~18min)、炒焦(18~24min)和炒炭(24~30min)四个阶段。2白术在麸炒过程中物质基础变化规律研究2.1白术在麸炒过程中糖类成分变化规律研究2.1.1白术在麸炒过程中多糖、还原糖和总糖含量变化规律研究采用紫外分光光度法对白术麸炒过程中多糖、还原糖和总糖的含量进行研究,结果发现随炮制时间延长,多糖含量均在12min之前呈增加趋势,之后含量开始降低;还原糖含量整体均呈逐渐增加的趋势,12~16min之后增长率明显提高;总糖含量在炮制前20min波动比较大,规律不尽相同,在炒制20~22min之后含量均逐渐下降。3批麸炒品和2批清炒品变化规律一致,提示辅料蜜麸对白术糖类成分的变化无实质性影响,此变化主要是由加热引起。2.1.2白术在麸炒过程中单糖及二糖含量变化规律研究采用HPLC-ELSD法比较不同麸炒程度白术水煎液中单糖及二糖含量变化,发现随炮制时间延长,白术水煎液中阿拉伯糖和葡萄糖的含量增加,果糖和蔗糖的含量降低,核糖和甘露糖为炮制过程中新产生的单糖。提示在白术炒制过程中,有其他成分转化为单糖,使其含量和种类发生变化,至于是否为多糖分解产生,仍需进一步研究。2.1.3不同麸炒程度白术多糖的单糖组成变化初步研究不同麸炒程度白术多糖组成不同,与0min白术多糖比较,麸炒4min和12min白术多糖中除了含有果糖、葡萄糖和D-木糖外,还含有阿拉伯糖,说明在炒制过程中,有新的单糖参与白术多糖的合成;而在麸炒20min时,多糖组成中又不含有D-木糖和阿拉伯糖,说明在炒制12min以后,白术多糖会发生糖基脱落,使组成减少。2.2白术在麸炒过程中挥发性成分变化规律研究本研究采用水蒸气蒸馏法测定白术炮制过程中挥发油含量的变化,结果白术麸炒后随炮制时间延长,挥发油含量随炮制火候变化呈四个阶段梯度降低,且清炒品与麸炒品变化规律一致。采用静态顶空进样,GC-MS结合自动质谱退卷积定性系统(AMDIS)和Kováts保留指数的方法,首次对不同麸炒时间点白术和蜜麸的挥发性成分的动态变化进行研究。结果发现白术和蜜麸中的挥发性成分在由生品到炒轻、炒黄、炒焦和炒炭的过程中依次发生显著变化。通过蜜麸与白术的挥发性成分比较,发现白术和蜜麸之间会相互吸附挥发性成分,其中蜜麸大量吸附白术中的苍术酮,实验结果表明白术在麸炒过程中的动态变化与炮制火候密切相关,且白术和蜜麸之间存在相互吸附作用,这可为阐明麸炒白术炮制机制提供科学依据。2.3不同麸炒程度白术和蜜麸中无机元素的比较研究采用ICP-OES和ICP-MS对不同麸炒程度白术和辅料蜜麸中微量元素和稀土元素进行测定,结果发现在白术麸炒过程中,Sn、Cd、Mo、Ni、Co、Mn、Cu、Cr、Fe等微量元素及La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu等稀土元素的含量均呈先增加后降低的趋势,除Zn和Cd外,其他8种微量元素在麸炒12min时含量最高,稀土元素在6min时含量最高。蜜麸生品中不含有稀土元素,在与白术炒制的过程中含量逐渐增加,6min后增加幅度降低。可见,麸炒后白术中无机元素含量变化明显;蜜麸对白术中微量元素的影响不大,对稀土元素的影响较大。2.4不同麸炒程度白术水煎液指纹图谱比较研究本课题建立了不同麸炒程度白术水煎液指纹图谱,通过对水煎液中的成分变化进行研究,结果发现由生品到炒黄阶段(0min~12min):白术化学成分相对稳定,指纹图谱相似度均>0.99,聚类分析结果也合为一类;炒焦阶段(16min~20min):化学成分开始出现增加,但与生品的相似度仍>0.90,说明整体水平变化不大;炒炭阶段(24min~30min):化学成分变化较为明显,5-HMF的含量急剧增加,白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量逐渐降为0,指纹图谱的相似度低至0.2。白术生品和炒黄品并未区分开,说明水煎液中具有紫外吸收的化学成分差别不大,两者的品质差异可能主要由糖类等不具有紫外吸收的化学成分引起。通过以上研究发现,白术麸炒过程中物质基础的变化呈现一定的规律性,糖类成分、挥发油和无机元素变化比较大,其中多糖和微量元素均在炮制12min时含量最高,而水煎液中具有紫外吸收的色谱峰在麸炒前20min无明显变化,初步推断糖类成分、挥发油和无机元素是影响不同炮制程度白术样品品质差异的关键因素。3不同炮制程度麸炒白术健脾作用和燥性副作用的比较研究3.1不同炮制程度麸炒白术的健脾作用比较研究针对麸炒白术功效特长选择经典的符合中医证候的大黄致脾阳虚泄泻动物模型,以稀便率、血清淀粉酶(AMS)、D-木糖含量和胃泌素水平为指标,比较麸炒不同程度(白术生品、麸炒4min、12min、20min、30min)对白术及白术多糖健脾作用的影响。研究结果显示,各白术水煎液及白术多糖均能表现出健脾的作用,综合4个健脾指标,麸炒12min达到炒黄状态时健脾作用最佳。多糖也具有健脾作用,说明白术多糖为白术发挥健脾作用的物质基础,白术麸炒过程中多糖含量的变化是引起麸炒白术品质变化的关键因素。3.2不同炮制程度白术水煎液的燥性副作用比较研究本实验通过给脾虚大鼠模型长期灌胃白术水煎液,比较不同麸炒程度白术的燥性副作用(对大鼠体内cAMP/cGMP和Na~+-K~+-ATP酶活性的影响)。结果发现,不同麸炒程度的白术水煎液均具有一定燥性。与白术生品水煎液比,麸炒12min白术水煎液可降低对脾虚大鼠血清cAMP/cGMP的影响;麸炒20min白术水煎液组可降低对脾虚大鼠肾脏Na~+-K~+-ATP酶活性的影响。可见,麸炒后白术的燥性会降低,且降低程度与麸炒程度密切相关,其中麸炒12min(炒黄)和20min(炒焦)白术水煎液的燥性相对较小。通过对不同麸炒程度白术的健脾作用及燥性副作用的比较研究,发现随白术炮制程度加深,其健脾作用先增强后降低,在麸炒12min达到炒黄状态时效果最佳,而麸炒后白术燥性也呈不同程度的降低。该研究成果可为白术最佳炮制点的确定提供有力的科学依据。4麸炒白术最佳炮制点的快速判别通过对白术麸炒过程中化学成分和药理作用的变化研究,确定麸炒白术最佳炮制点为麸炒12min达到炒黄状态,本课题以白术麸炒过程中饮片表面颜色变化表征“火力火候”的变化,采用分光测色技术对不同麸炒时间点白术样品的颜色进行测定,采用SPSS21.0统计分析软件对测定结果进行分析,确定麸炒白术最佳炮制点的客观量化标准为:颜色值达到L*(46.26±4.95),a*(13.87±1.65),b*(33.27±3.55)。该方法方便快捷,可达到快速判别炮制终点的目的,为其他炮制工艺的现代化研究提供借鉴和参考。