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目的:采用蛋白质组学技术,检测健康志愿者与慢性乙型病毒性肝炎(简称慢性乙肝)湿热中阻、肝郁脾虚、瘀血阻络、肝肾阴虚及脾肾阳虚五种中医证候患者外周血浆中差异表达的蛋白质,分析这些差异表达的蛋白质与机体免疫反应状态之间的关系,初步探索出慢性乙肝各中医证候所处免疫反应状态之蛋白质组学规律,为临床辨治慢性乙肝提供可供参考的客观依据,也为进一步探讨慢性乙肝中医证候的分子基础提供线索。
方法:依据《病毒性肝炎中医辨证标准》,于2009年10月-2010年9月期间,在泸州医学院附属中医医院住院和门诊的慢性乙肝患者中,收集典型的湿热中阻证(Ⅱ)、肝郁脾虚证(Ⅲ)、脾肾阳虚证(Ⅳ)、肝肾阴虚证(Ⅴ)、瘀血阻络证(Ⅵ)及健康正常人(Ⅰ)共105例作为研究对象。首先每种证型取5例样本,对其血浆蛋白进行双向凝胶电泳,切取标准化总灰度值(％Vol)相差达2倍以上,且在慢性乙肝五种中医证候中均存在明显规律性变化的差异表达蛋白点进行质谱分析,搜索SWISS—PROT数据库,鉴定出以上差异表达的蛋白质。在这些差异表达的蛋白质中筛选出能反映机体免疫反应状态的蛋白质,扩大样本量,每种证型取20例,正常对照组取5例,应用ELISA技术对以上差异表达蛋白进行验证,分析这些差异表达的蛋白质与机体免疫反应状态之间的关系,探索其中的蛋白质组学规律。
结果:(1)获得了分辨率和重复性均较好的血浆蛋白双向电泳银染图谱,初步建立起慢性乙肝肝郁脾虚、湿热中阻、肝肾阴虚、脾肾阳虚、瘀血阻络证组及健康人对照组血浆蛋白质组表达图谱。(2)通过对比分析健康人对照组、慢性乙肝病人湿热中阻证组、肝郁脾虚证组、瘀血阻络证组、肝肾阴虚证组及脾肾阳虚证组的双向电泳图谱,在五种证候中均存在明显规律性差异表达的蛋白点共有五个,通过质谱鉴定,确定为结合珠蛋白(HP)、免疫球蛋白J链(Ig-J)、视黄醇结合蛋白(RBP)、C-反应蛋白(CRP)、玻连蛋白(VN)。(3)选取其中主要与肝脏功能状况相关的视黄醇结合蛋白(RBP)、结合珠蛋白(HPT)以及主要与机体体液免疫功能相关的免疫球蛋白J链(Ig-J)进行ELISA法检测,发现在各证候组中,反应肝脏功能状况的蛋白质——视黄醇结合蛋白(RBP)、结合珠蛋白(HPT)均较正常对照组降低(P<0.05)。其中,各证候组视黄醇结合蛋白(RBP)与正常对照组比较均降低,其降低顺序(降低最多排前)为:Ⅵ>Ⅴ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅱ,中医证候组间比较Ⅳ与Ⅲ间有显著性差异(P<0.05)；各证候组结合珠蛋白(HPT)与正常对照组比较均降低,但组间差异无统计学意义(P>0.05)。在各证候组中,反应机体体液免疫反应状态的蛋白质——免疫球蛋白J链(Ig-J)均较正常对照组升高,升高顺序为(升高最多排前)Ⅵ>Ⅴ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅱ,各中医证候组与正常组比较均有显著性差异(P<0.05),且中医证候组间比较均有显著性差异(P<0.05)。
结论:1.初步建立慢性乙肝肝郁脾虚组、湿热中阻组、肝肾阴虚组、脾肾阳虚组、瘀血阻络组及健康人对照组血浆蛋白质组表达图谱。2.慢性乙肝五种中医证型患者与正常人比较存在多个蛋白质表达差异,表明慢性乙肝不同中医证候患者存在多蛋白表达异常,此为中医“证”本质研究奠定了科学基础。3.在慢性乙肝五种证型中,反映机体体液免疫状态的免疫球蛋白J链相对于正常对照组均升高,其中以瘀血阻络证组升高最为明显,其次为肝肾阴虚证组、脾肾阳证虚、肝郁脾虚证组,最低为湿热中阻证组。提示慢性乙肝患者存在体液免疫功能紊乱,且不同证型之间免疫紊乱程度不同。其中,瘀血阻络证组免疫紊乱最重,其次为肝肾阴虚证组、脾肾阳证虚、肝郁脾虚证组,湿热中阻证组免疫紊乱最轻。4.在慢性乙肝五种证型中,反应肝功能损害程度的视黄醇结合蛋白、结合珠蛋白与正常对照组比较均降低。其中,视黄醇结合蛋白以瘀血阻络证组降低最明显,其次为肝肾阴虚证组、脾肾阳虚组、肝郁脾虚证组,湿热中阻证组最高。说明慢性乙肝各中医证型患者均存在不同程度的肝功能损害,其中,以瘀血阻络证肝功能损害最为严重,湿热中阻证相对最轻。5.在慢性乙肝五种中医证候中,肝功能损害程度与机体免疫功能紊乱之间存在正相关性,即免疫功能紊乱程度越重,其肝功能损害程度就越严重。