香蕉枯萎病菌疏水表面结合蛋白A的基因功能研究

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由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起香蕉枯萎病,给我国和世界香蕉产业造成了严重损失;其中以4号生理小种(Foc4)的危害最为严重。挖掘Foc的致病相关基因,并探究其致病机理,可为香蕉枯萎病的防控提供理论依据和实践基础。分泌蛋白作为一类重要的致病分子,在Foc的致病过程中扮演着重要角色。在本研究室的前期工作中,应用分泌蛋白质组学技术,发现在香蕉组织提取物诱导后疏水表面结合蛋白A(HSBA)的表达量显著上调。本研究采用基因敲除和基因回补等技术,并通过表型分析、胁迫反应测定和致病力分析等,对Foc4中Fo HSBA的基因功能进行了研究;应用q RT-PCR技术,对其生长发育相关基因和致病相关基因的表达进行了分析。具体结果如下:(1)采用实时荧光定量PCR技术,对Foc4中Fo HSBA基因表达进行了分析。结果表明,受到香蕉组织提取物诱导后,Fo HSBA在7 h、10 h和24 h时表达显著上调,与分泌蛋白质组的结果相符合。(2)采用split marker同源重组技术,对Foc4中Fo HSBA进行了基因敲除;通过PEG介导的原生质体转化法,获得了90个潮霉素抗性转化子。采用PCR技术进行分析,有15个转化子被证实含有潮霉素基因、不含Fo HSBA基因,为候选的阳性转化子。随机挑选了其中的5个候选转化子进行Southern blot分析和q RT-CR验证分析,获得了1个敲除突变体△Fohsba。通过构建基因回补载体和应用PEG介导的原生质体转化法,采用PCR技术验证获得了5个回补突变体△Fohsba-com。(3)对△Fohsba和△Fohsba-com进行了表型分析。结果表明△Fohsba在PDA平板上的菌落生长速率显著低于野生型,气生菌丝稀疏、产孢量降低、小型分生孢子比例增加,而△Fohsba-com则恢复到Foc4野生型水平。(4)对△Fohsba和△Fohsba-com的细胞壁完整性进行分析,结果表明在含刚果红的PDA培养基上,△Fohsba的耐受性增强,其受抑制程度显著低于Foc4野生型和和△Fohsba-com;在含CFW的PDA培养基上,△Fohsba抑制率与Foc4野生型和△Fohsba-com没有显著差异。(5)对△Fohsba和△Fohsba-com的穿透能力及定殖能力进行分析。结果表明,△Fohsba不能穿透玻璃纸,且在番茄上的定殖能力减弱;△Fohsba-com能穿透玻璃纸,在番茄上的定殖能力与Foc4野生型没有明显差异。(6)对△Fohsba和△Fohsba-com的致病力进行分析。结果表明,接种△Fohsba后,巴西蕉幼苗叶片仅下部叶片出现黄化,球茎变色面积较小,其病情指数显著低于Foc4野生型;而?Fohsba-com的致病力则恢复至Foc4野生型水平。(7)利用qRT-PCR技术,对△Fohsba生长发育相关基因、几丁质合成基因和角质酶基因的表达进行了分析。结果表明,与野生型相比,在△Fohsba接种后,3个生长发育相关基因(FOIG_02194、FOIG_07247和FOC4_g10010682)、2个几丁质合成基因(Fochs3和Fochs V)和3个角质酶基因(FOC4_g10002722、FOIG_00223和FOIG_08972)的表达在其生长发育的各个阶段都有不同程度的降低,进一步说明了FoHSBA基因影响香蕉枯萎病菌生长发育、细胞壁组成和穿透能力这些与致病力相关的功能。
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