T-2毒素是毒性最强的A型单端孢霉烯族化合物,也是一种常见的引起动物骨发育不良的真菌毒素。T-2毒素引起的肉鸡骨发育异常主要表现为胫骨生长板软骨发育不良。发病鸡胫骨生长板软骨细胞不能进行正常的软骨内骨化,在骨骺端形成软骨栓楔入骨骺甚至深入到骨髓腔,引起病鸡关节畸形,胫骨干髓区脆弱,最终导致骨折发病率大大增加。研究表明,此种疾病的主要原因是骨骺生长板软骨细胞发育停滞、凋亡或坏死进而造成正常的软骨内骨化过程紊乱。然而,过去关于T-2毒素对骨系统毒害作用的体内与体外研究主要集中在发病动物胫骨的病理变化和T-2毒素对关节软骨细胞体外代谢的影响等方面的研究,对T-2毒素作用于长骨发生器官生长板软骨细胞的毒性研究相对较少。因此,为揭开T-2毒素对生长板软骨细胞毒害作用和为生产实践提供科学的防治方法,同时为T-2毒素引起的人或动物疾病机理的研究提供借鉴,本试验利用本实验室建立的鸡生长板软骨细胞的体外培养体系,展开T-2毒素对生长板软骨细胞的毒害及机制的研究。试验Ⅰ鸡生长板软骨细胞的分离、培养与生物学特性的研究体外培养的原代生长板软骨细胞是研究骨生长板发育及调节的一个重要工具,对软骨组织工程的研究也有重要的意义。同时,各种原因导致的生长板软骨发育不良的疾病机制的深入研究,也促使建立一种简易、高效的生长板软骨细胞体外的培养方法。本试验收集6 w龄肉鸡的胫骨生长板,削成薄片后置于含有0.1%胶原酶和0.1%透明质酸酶的消化液中,37℃消化14～16h。经梯度离心获得的软骨细胞悬浮于高糖DMEM(含10％FBS)培养基,然后按105个/cm2接种于培养板,观察和分析软骨细胞的生物学特征。应用MTT法测定软骨细胞增殖速度并绘制生长曲线,倒置显微镜和电镜下观察软骨细胞的形态结构、甲苯胺蓝染色鉴定细胞分泌的基质和用Ⅱ型胶原和骨钙素的免疫组织化学法进一步鉴定软骨细胞分泌的特异性蛋白。同时,试验过程中测定了软骨细胞胶原蛋白和酸性蛋白聚糖的含量变化、碱性磷酸酶的活性和软骨细胞肥大化时的特异性基因Ⅹ型胶原mRNA的表达。最后用茜素红结合试验测定软骨细胞在体外的钙化能力。结果表明,采用本试验方法所分离的生长板软骨细胞成活率达98%以上；原代培养细胞呈圆形或多角形且Ⅱ型胶原阳性染色细胞比例大于98%。碱性磷酸酯酶、胶原及细胞外基质合成和Ⅹ型胶原mRNA表达随细胞培养时间的延长出现了一个周期性的变化。软骨细胞培养初期添加25μg·mL-1的维生素C有助于防止软骨细胞退化。结论：本试验建立的生长板软骨细胞分离、培养方法可获得高纯度、高活性的软骨细胞。分离培养的软骨细胞可在体外培养过程中保持表型,逐渐成熟和最终矿化软骨细胞外基质,为探讨其生物学特性、软骨细胞增殖分化的调控和软骨组织工程的研究建立了基础。试验Ⅱ无机磷诱导的生长板软骨细胞体外钙化体系的建立磷是参与动物骨代谢的重要元素之一,它在生长板软骨细胞终末分化过程中起着重要的作用。本试验通过在体外培养的生长板软骨细胞的培养基中添加不同浓度的无机磷(0-7 mmol·L-1),研究磷在体外环境下对细胞终末分化及钙化的影响。试验结果表明,(1)无机磷可降低软骨细胞增长速度,促进软骨细胞的分化；(2)磷对成熟型的生长板软骨细胞的促进钙化作用明显,对不成熟软骨细胞的钙化促进作用较小；(3)磷诱导软骨细胞钙化的能力与软骨细胞体外培养的时间和细胞的汇合程度密切相关,即培养时间越长,汇合程度越高,磷诱导其钙化的速度越快,且诱导钙化需要的磷的浓度也越低；在此过程中,细胞开始钙化时,细胞内碱性磷酸酯酶的活性最高。(4)高浓度(7 mmol·L-1)的无机磷引起细胞的迅速死亡。茜素红染色表明,高浓度与低浓度无机磷形成的钙化结节的机制可能不一样,添加3 mmol·L-1的无机磷更有助于软骨细胞的生理性钙化作用。通过此种方法建立的生长板软骨细胞体外钙化体系为下一步关于软骨细胞钙化机制的研究奠定了基础,同时也为研究那些影响软骨细胞钙化过程的因素提供一个可体外操作的研究的体系。试验ⅢT-2毒素对生长板软骨细胞增殖、分化和钙化的影响T-2毒素是常见的影响动物骨发育的毒素之一,它可引起快速生长的肉鸡胫骨生长板的肥大软骨细胞不能正常的钙化,导致骨骺软骨发育畸形。本试验利用本试验室建立的软骨细胞体外培养体系研究T-2毒素对体外培养的软骨细胞增殖、分化和钙化的影响,为进一步研究T-2毒素引起动物骨发育不良的机理打下基础。鸡生长软骨细胞分离、培养到汇合后培养在含3 mmol·L-1无机磷的矿化培养基中,同时细胞培养液中加入不同浓度的T-2毒素,观察与测定与软骨细胞增殖、分化和钙化相应指标。结果显示,T-2毒素能显著降低软骨细胞的活力(P<0.05)。同时,软骨细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性、蛋白聚糖的合成、培养细胞矿化及细胞基质层钙、磷沉积量均显著降低(P<0.01)。实时荧光定量PCR研究表明,暴露于T-2毒素的的软骨细胞中的X型胶原、血管内皮生长因子及转录相关因子RUNX2的mRNA水平也相应的降低(P<0.05)。结论：T-2毒素可通过改变细胞的代谢活性和调节软骨细胞发育相关基因的表达来抑制软骨细胞的增殖分化以及随后的矿化。试验ⅣT-2毒素对生长板软骨细胞凋亡及Caspase-3基因表达的影响T-2毒素可对人和动物的多种器官产生毒害作用,诱导细胞凋亡可能是T-2毒素发挥毒害作用的重要途径之一。本试验通过在体外分离培养的软骨细胞中添加不同浓度的T-2毒素,研究T-2毒素对培养软骨细胞凋亡的影响。采用流式细胞术测定T-2毒素处理的软骨细胞凋亡、活性氧、线粒体跨膜电位和自由[Ca2+]i的变化,Hoechst33342染色后荧光显微镜观察细胞核结构的变化。同时应用Real-time RT PCR的方法测定细胞凋亡相关基因Caspase-3 mRNA表达量。应用生物化学测定法测定软骨细胞内GPx活性。结果显示,T-2毒素可引起软骨细胞内ROS、自由[Ca2+]i升高、线粒体跨膜电位降低(P<0.05)。Hoechst 33342染色后,荧光显微镜下观察可发现细胞核发生凝集,呈现凋亡时核形态变化。同时,细胞内抗氧化酶GPx有一定程度的升高。试验结果表明,T-2毒素可通过引起软骨细胞稳态失衡导致生长板软骨细胞发生凋亡性死亡。试验ⅤT-2毒素引起的生长板软骨细胞氧化应激及NAC的保护作用T-2毒素是一种可引起动物多种骨发育畸形的常见真菌毒素。T-2毒素引起的氧化应激是T-2毒素引起动物发病的重要病理机制之一。在本试验中,原代培养的软骨细胞给予不同浓度T-2毒素(5,50,500 nmol·L-1)处理后,通过在培养基中添加抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)研究它对T-2毒素引起的氧化应激的颉颃作用。结果表明,T-2毒素可引起软骨细胞细胞活性,细胞内ALP活性和细胞内GSH显著降低(P<0.05)。同时,软骨细胞内ROS和MDA含量升高。软骨细胞为了保护自身免受氧化应激的损伤,提高了细胞内过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。进一步研究发现,抗氧化剂NAC在一定程度上抑制了T-2毒素引起的生长板软骨细胞的氧化应激。结果提示,NAC可通过降低软骨细胞氧化应激水平来保护软骨细胞免受T-2毒素的危害。