代谢是生物体不断进行物质和能量交换的过程,包括机体与外界环境的交换以及生物体内的自我更新。糖类、脂质、氨基酸及低分子肽等代谢物对生物体中的重要生命活动,包括信号释放、能量传递、细胞通信等起着关键的调控作用。当人体的蛋白质、脂肪与碳水化合物发生代谢紊乱,易导致糖尿病、肥胖、高血压、心脑血管等疾病,而此类慢性代谢综合征又可能引发癌症。同时,癌症也被称为一种“代谢异常疾病”,致癌基因引发的异常三羧酸循环与脂质代谢均被认为与癌症的发生密切相关。因此代谢物不仅是人体健康水平的重要指标,也可作为癌症检测的生物标志物,对人体组织及体液中代谢物的有效监测具有重要意义,尤其是基于大量代谢物的定性及定量分析结合多分子模式识别,正成为一种新型的恶性肿瘤等高危疾病的精准诊断策略。目前在临床上的代谢物检测中使用的常规生化分析和免疫分析方法仅限于检测葡萄糖、尿素、尿酸、胆红素、总甘油三酯等简单代谢物,难以实现多代谢物的并行分析。核磁共振(NMR)和质谱(MS)为两大新型代谢组学分析平台,能够对不同类型的代谢物进行多维检测分析。相较而言,质谱分析具有高准确性、高灵敏度、高涵量的优点,非常适合研究代谢物指纹谱图的改变与疾病发生之间的联系。然而,目前对代谢组的质谱分析大多需经过复杂的提取及样本预处理过程,存在耗时长、重复性差等问题,使其依旧难以应用于生物样本代谢物的快速临床分析与疾病诊断。本论文旨在发展一种兼具有良好萃取转印与免基质质谱检测功能的硅纳米线(SiNWs)芯片,以此材料为基础,建立一种快速的顶端接触取样/离子化质谱(TCSI-MS)检测技术。论文研究了 SiNWs阵列芯片上的顶端增强光致电子转移效应,提出并验证半导体纳米材料的表面辅助激光解吸离子化质谱(SALDI-MS)中的电子转移机理。并将SiNWs芯片应用于生物样本表面的快速接触式采样与分析,采集的代谢物谱图能够反映生物分子特性和区域分布差异性,结合统计分析能够对肿瘤组织实现精准鉴定和亚型判别,发现潜在的肿瘤特异性脂质生物标志物。本论文的主要内容如下:在第一部分(第一章)内容中,我们首先概述了代谢与疾病的相关性及代谢组的提取、检测与数据分析方法。重点综述了新型质谱技术在代谢物快速检测与疾病诊断中的应用。同时介绍了半导体纳米材料在复杂生物样本的提取及质谱中的应用进展,以及SALDI-MS的主要机理,并提出了本论文的选题意义。第二部分(第二章)主要探讨SiNWs应用于SALDI-MS检测中的顶端增强电子转移机理。一方面,借助于紫外吸收、场致离子化及时域有限差分法(FDTD)模拟对SiNWs顶端电场增强进行辅助判断,另一方面基于靛蓝、靛红、苄基吡啶离子(BP+)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)等模型分子的质谱行为对SiNWs表面的增强型电子转移机理进行验证。结果表明,具有尖端的硅纳米线具有更强的顶端场强与电子转移能力,SiNWs表面修饰还原氧化石墨烯(rGO)后形成具有复合结构的SiNWs@rGO时,两种纳米材料体现出协同作用。且在SLADI过程中,电子转移对分析物负离子模式下的解吸离子化起主导作用,而正离子模式下解吸与质子转移共同起重要作用。优异的免基质基底是复杂生物样本质谱检测的首要前提,基于SiNWs的顶端增强电子转移效应,吸附于SiNWs表面的分子,包括皮肤表面的内源性代谢物和外源性物质、果蔬表面的农药均可以实现原位检测。该部分的机理探讨与材料优化为TCSI-MS技术的提出奠定基础。SiNWs阵列结构不仅具有良好的能量吸收与电荷转移功能,且其独特的纳米尖端可作为微萃取头,尤其适合于组织等软表面的分子萃取转印。将采样与质谱检测相结合,可实现复杂组织样本的快速检测。在第三部分(第三章)工作中,我们重点探讨TCSI-MS在组织样本表面对代谢分子的萃取转印与质谱检测过程。具有不同表面化学及有无rGO修饰的SiNWs显示出不同的萃取及检测性能。通过调整顶端接触取样(TCS)时间探究了 TCSI-MS在组织表面的分子转印中的动力学过程。多组织的TCSI-MS检测分析结果表明其获取的组织表面代谢物具有组织微环境特异性,可辨别来自不同器官的组织、同组织不同微区的分布。TCSI-MS不仅适用于离体组织,也适用于对活体组织的脂质分子的转印和质谱检测,体现其在临床术中用于组织鉴别与诊断中的巨大潜力。TCSI-MS在组织表面获取的分子大多为脂质分子,而脂质分子的合成与代谢异常已被发现与癌症的发生、发展和转移过程密切相关,因而脂质分子群可以作为生物标志物用于肿瘤组织的精准鉴别。基于第二、三部分的工作基础,我们在第四部分(第四、五章)工作中主要探讨TCSI-MS在肾细胞癌(RCC)组织和肝细胞性肝癌(HCC)的快速鉴别中的应用。我们通过TCSI-MS获取30例RCC组织及其癌旁组织以及20例HCC组织及其癌旁、正常肝组织的脂质谱图。对于RCC组织,我们选用SiNWs芯片为萃取检测芯片,发现RCC的癌组织与非癌组织在负离子模式下的谱图中显示出明显差异。而对于HCC组织的代谢分子的原位萃取和检测,rGO与SiNWs的复合能够提高负离子模式下的磷脂检测信号,同时能增加正离子检测模式中的磷脂酰胆碱(PC)、鞘磷脂(SM)、甘油三酯(TG)等分子的信号量,与负离子模式下的谱图相结合,增加差异性维度。同时,我们提出以相邻双峰的比例信息为基础的HCC组织判别方法,以避免不同结构的脂质分子之间的信号互相抑制作用,减少磷脂分子的源内裂解对信号的影响,从而增强信息的稳定性。多组双峰的比例值在HCC肿瘤组织和非肿瘤组织直接存在显著性差异。RCC和HCC组织的判别可通过主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)、线性判别分析(LDA)等统计学方法进行区分。多种预测模型均显示出较高的敏感性、特异性与准确性。而RCC中包含的三种主要亚型以及具有不同细胞起源的原发性肝癌可根据其特征脂质分子得以区分。RCC的亚型肿瘤的其亲疏远近关系可通过聚类结果显示,与临床的预后及已报道的亚型RCC肿瘤组织的基因表达相似性有关。具有肿瘤特异性的硫苷脂分子的组成及差异在肾功能异常及癌化中发挥着重要作用。而HCC组织表面的特征性脂肪酸双峰不仅能够清晰地判别成像实验中的肿瘤边界,也提示在发生癌化的肝细胞中存在亚油酸和花生四烯酸相关的异常脂肪酸代谢,而良性肝肿瘤中却不存在此异常代谢。该部分工作表明TCSI-MS结果不仅能够作为术中切缘是否阴性的判别依据,且可辅助肿瘤的精准诊断与肿瘤边界成像。肿瘤细胞中结构相似、分子量相近的分子不仅包括脂质分子,还包括多肽、蛋白分子。在第五部分(第六章)中,我们发展了基于MALDI-MS中的双峰比值信息对多种HCC细胞进行鉴定和相对定量的方法。根据其在MALDI-MS中的强度比值,可以在细胞和组织层面对不同HCC细胞实现定性和定量的鉴定,相较于单峰具有更高的稳定性和胞内高保守性。同时,该章也定义了一种新型“双分子标志物”,可应用于肿瘤异质性研究。