脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON),是一种由镰刀菌属产生的具有高毒性的B类单端孢霉烯族真菌毒素,广泛分布于禾谷类作物中。虽然可以采取多种措施降低其污染程度,但食源性DON的暴露仍不可避免,因此对其体内毒性作用的预防和干预对于公众健康尤为重要。毒理学研究表明DON可严重破环肠道屏障稳态,引发多种毒性症状,因此肠道屏障稳态可能是体内预防和干预DON毒性的重要靶标。虽然有很多研究发现了植物化学物质对肠道屏障稳态的增强作用,但针对DON所引起的损伤,选择合适的植物化学物质进行预防或干预的研究却鲜有报道。植物化学物质山奈酚(KAM)是一种广泛分布于水果和蔬菜中的天然多酚类化合物,除了抗癌、抗氧化以及抗炎症活性外,它也具有增强Caco-2细胞单层模型完整性的作用。因此,本研究将采用营养学方法,探究KAM预处理对DON所导致的肠道屏障功能障碍的预防作用及其机制。具体研究内容及结果如下:1.建立模拟人体肠道上皮屏障的Caco-2细胞单层模型。通过对其完整性、通透性和细胞极性的测定验证模型的成功构建。对橙皮素、槲皮素、山奈酚、白藜芦醇、小檗碱、儿茶素和柚皮素等7种植物化学物质进行筛选,发现KAM预处理具有最佳效果。综合DON及KAM对Caco-2细胞增殖抑制率和模型通透性的影响,选择5?M DON和100?M KAM作为试验浓度,初步探究二者对Caco-2模型细胞活性、氧化应激以及细胞连接等生物功能的影响,结果表明KAM预处理对于DON引起的细胞紧密连接损伤有明显的改善作用。2.探究DON及KAM对不同增殖分化阶段Caco-2细胞连接的影响。为模拟肠上皮细胞的快速增殖与分化,选择建模的第3、11和21天三个时间点进行研究。结果表明,DON及KAM对Caco-2细胞模型完整性和紧密连接蛋白表达的影响高度依赖于细胞所处的增殖分化阶段。在细胞快速增殖期(第3 d),DON和KAM都能够显著减缓细胞电阻值的增加;而在中期(第11 d),同样剂量的DON和KAM反而显示出了促进作用;细胞分化成熟后(第21 d),DON显著降低了细胞单层的完整性,而KAM预处理发挥了明显的改善作用。不同增殖分化时期紧密连接蛋白表达的变化表明claudin 4与DON具有密切的相关性,而KAM可通过上调claudin 3发挥作用,因此claudin蛋白可能是DON和KAM作用的靶蛋白。3.鉴于DON对蛋白质合成的抑制作用,采用蛋白质组学的方法研究KAM对Caco-2细胞模型单层完整性的保护作用及其机制。GO分析表明KAM、DON以及KAM+DON组在细胞黏附分子结合(MF)、细胞连接(CC)和细胞连接装配(BP)中都有显著的富集(p<0.05)。对KEGG富集结果进行层次聚类分析显示,KAM预处理对紧密连接、黏附连接和细胞骨架相关蛋白有明显改善作用。进一步的通路分析和WB验证表明,KAM预处理分别通过PKA途径和MAPK/ERK途径影响了紧密连接和黏附连接蛋白的表达和装配从而改善了DON引起的Caco-2细胞模型屏障功能损伤。4.为更全面了解DON及KAM作用后肠道屏障功能与其它生理过程之间的关系,对处理后的Caco-2细胞模型进行代谢组学分析,并结合蛋白质组学做组学关联分析。结果表明,各处理组间差异代谢物的数量和种类有明显区别,其中KAM+DON组有数量最多的显著性差异代谢物,且磷脂类代谢物变化明显。KAM组除了对嘌呤代谢和脂肪酸生物合成影响较为明显外,对氨基酸代谢相关通路也有广泛作用。KAM+DON组与DON单独作用组的代谢通路较为相似,二者对氨基酸代谢都有较大影响,其中最为显著的氨酰-t RNA生物合成通路与蛋白质合成密切相关。代谢组学和蛋白组学的关联分析表明,KAM及DON主要通过对t RNA连接酶蛋白表达的作用影响氨酰-t RNA生物合成通路,通过对醛脱氢酶、酰基甘油激酶、果糖二磷酸醛缩酶、乙醇脱氢酶和酰基甘油脂肪酶等的调节对甘油磷脂产生影响。5.最后,采用BALB/c小鼠模型,验证KAM预处理在体内对DON引起的肠道损伤的预防效果,同时研究肠道菌群与肠道屏障稳态之间的关系。结果表明,KAM预处理明显改善了DON引起的肠道绒毛损伤,降低了血清中FD-4和zonulin含量,提高了c NOS含量以及TC和HDL-C浓度,显示了其对DON引起的肠道屏障功能障碍和低度炎症反应的改善作用。此外,DON对短链脂肪酸代谢和肠道菌群会产生明显的不利影响,Erysipelotrichaceae丰度的增加以及毛螺菌科和瘤胃菌科丰度的降低可能与DON引起的肠道损伤相关。而KAM预处理能够增加DON引起的物种丰度的降低,并可通过减少Erysipelotrichaceae降低兼性厌氧菌和肠道炎症从而对肠道屏障稳态发挥一定的改善作用。