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油菜素类固醇(brassinosteroids,BRs)是一类发现较晚、结构特别、活性较高、作用广谱的植物生长调节物质(激素)。DWF4(dwarf4)和CPD(constitutive photomorphogenesis and dwarfism)被认为是编码BR生物合成途径中限速反应酶的基因。近二十年来,随着研究技术的发展和BRs合成缺陷与不敏感突变体的发现,有关BRs的研究取得了很多突破性的进展。在生物合成方面,关于它的合成途径已基本清楚,调控BRs合成的基因大部分也已经被克隆,但这些研究都主要集中在拟南芥、水稻、玉米等少数几种草本植物中,在其他植物,尤其是在那些生态效益和经济效益重大的木本植物中少有研究。为了了解草、木本植物间在BR的生物合成与遗传机制方面的差异,此前本实验室以胡杨(Populus euphratica)为材料,克隆出了与拟南芥CPD(At CPD)同源的c DNA序列(命名为Pe CPD),建立了拟南芥-Pe CPD转基因系(Pe CPDTL),初步研究了该基因的功能(Wu et al,2014)。本研究同样以胡杨为材料,克隆出了与拟南芥DWF4(At DWF4)同源的c DNA序列(命名为Pe DWF4),建立了拟南芥-Pe DWF4转基因系(命名为Pe DWF4-TL),并将此Pe DWF4-TL与上述的Pe CPD-TL人工杂交获得了拟南芥-Pe DWF4-Pe CPD双转基因系(Pe CP/DW-TL)。在此基础上,在完全相同的条件下,系统分析比较了这三个转基因系之间在形态学、生理学、遗传学、解剖学、生物化学、分子生物学、蛋白质组学等方面的差异,以期了解Pe DWF4在调节植物生长发育中的作用、Pe DWF4和Pe CPD的功能差异以及Pe DWF4和Pe CPD间的相互作用。主要结果如下:1生物信息学分析发现:克隆到的Pe DWF4 c DNA全长1667bp,其中包含一个完整的长1470bp的编码框,编码一个长490个氨基酸的蛋白质。该蛋白属于CYP90B家族,与At DWF4(CYP90B1)的氨基酸序列的同源性为72.53%,与Pe CPD(CYP90A)的同源性为38.95%,与某些草本植物(雷蒙德氏棉、陆地棉)CYP90B的同源性高于其与某些树木(桃树、巨桉)CYP90B的同源性。2形态学研究发现:与野生型(WT)相比,Pe DWF4-TL的叶变细变长变卷曲,叶面积减小;Pe CPD-TL的叶与WT的相似,但叶面积增大;Pe CP/DWTL的叶与Pe DWF4-TL相似,但变得比Pe DWF4-TL的更细、更长、更卷曲。Pe DWF4-TL、Pe CPD-TL与Pe CP/DW-TL的株高都显著增加,但Pe CPD-TL增高的的幅度大于Pe DWF4-TL,Pe CP/DW-TL增高的的幅度又大于Pe CPD-TL。此外,Pe DWF4-TL的花序茎变细,Pe CPD-TL的花序茎增粗,Pe CP/DW-TL的花序茎直径介于Pe DWF4-TL与Pe CPD-TL之间(与WT相近)。3遗传学分析发现:Pe DWF4-TL花期提前,Pe CPD-TL花期滞后,Pe CP/DW-TL花期介于Pe DWF4-TL与Pe CPD-TL之间(与WT相近);Pe DWF4-TL、Pe CPD-TL与Pe CP/DW-TL的果荚都增大,但是Pe CPD-TL的大于Pe DWF4-TL的,Pe CP/DW-TL的又大于Pe CPD-TL的。Pe DWF4-TL、Pe CPD-TL与Pe CP/DW-TL中果荚数目和种子产量也都降低,但Pe DWF4-TL降低的幅度大于Pe CPD-TL降低的幅度,Pe CP/DW-TL降低的幅度又大于Pe DWF4-TL降低的幅度。此外,Pe DWF4-TL中有大量畸形和败育果荚出现,Pe CPD-TL无畸形或败育果荚出现,Pe CP/DW-TL也有大量畸形和败育果荚出现,但比例超过Pe DWF4-TL。此外,Pe DWF4-TL在抽薹期、花序茎直径、果荚发育及种子产量等方面完全不同于以前Choe等(2001)建立的拟南芥At DWF4过表达系。4生理生化研究发现:与WT相比,Pe DWF4-TL光系统II的最大光化学效率(ΦPSII)、光合量子产量(PQY)、电子传递效率(ETR)降低;Pe CPD-TL的ΦPSII与PQY都升高,ETR与WT的相近;Pe CP/DW-TL的ΦPSII和PQY与WT的相近,但ETR减小。Pe DWF4-TL中叶绿素a和b(Chl a和Chl b)含量都显著降低,但Pe CPD-TL中Chl b含量升高、Chl a未变,Pe CP/DW-TL中Chl a与Chl b含量也显著降低,降低程度与Pe DWF4-TL相似。Pe DWF4-TL茎木质素和纤维素的含量均显著降低,但Pe CPD-TL的均显著升高,Pe CP/DW-TL的介于Pe DWF4-TL与Pe CPD-TL之间(与WT相似)。5显微结构观察发现:与WT相比,Pe DWF4-TL花序茎横切面面积和髓部面积减小;Pe CPD-TL花序茎横切面、木质部、韧皮部及髓部面积都明显增大;Pe CP/DW-TL茎横切面面积与WT相近,但木质部与韧皮部面积增大,髓部面积减小。6 RT-PCR和RT-q PCR检测Pe DWF4、Pe CPD、At DWF4、At CPD、At BR6OX2、At FLC、At TCP1、At GA5的转录水平发现:Pe CPD或Pe DWF4在Pe CPD-TL或Pe DWF4-TL中表达,Pe CPD与Pe DWF4在Pe CP/DW-TL中都表达,在WT中都不表达。At DWF4、At CPD、At BR6OX2、At FLC、At TCP1、At GA5在WT和所有转基因系中都表达。Pe DWF4-TL中,Pe DWF4的表达使At DWF4、At CPD、At BR6OX2、At TCP1、At FLC及At GA5的转录水平下调;Pe CPD-TL中,Pe CPD的表达使At DWF4、At BR6OX2、At TCP1及At FLC的转录水平下调,At CPD和At GA5转录水平上调。Pe CP/DW-TL中,Pe DWF4和Pe CPD的转录水平显著低于它们在Pe DWF4-TL和Pe CPD-TL中的转录水平,At DWF4、At BR6OX2、At FLC以及At TCP1的转录水平与它们在Pe DWF4-TL中的转录水平接近,但低于它们在Pe CPD-TL中的转录水平,At CPD和At GA5的转录水平介于Pe DWF4-TL与Pe CPD-TL之间。7 ELISA检测发现:与WT内源BRs含量(1.937μg g-1FW)相比,Pe DWF4-TL中内源BRs含量(2.567μg g-1FW)显著升高,Pe CPD-TL中内源BRs含量相反的显著降低(1.323μg g-1FW),Pe CP/DW-TL中内源BRs含量(2.1731μg g-1FW)低于Pe DWF4-TL中,但高于Pe CPD-TL中。8双向电泳-MALDI-TOF-TOF串联质谱分析发现:WT、Pe DWF4-TL、Pe CPD-TL与Pe CP/DW-TL中蛋白点总数分别为704、633、732和723。Pe DWF4-TL和Pe CPD-TL与WT的匹配率分别为65.56%与62.6%;Pe CP/DWTL与Pe DWF4-TL和Pe CPD-TL的匹配率分别为39.56%与41.63%。在成功鉴定的10个差异蛋白中,其中包括黑芥子酶1(N16)、类1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(N18)、类甘氨酸羟甲基转移酶(N19)、硫代葡萄糖苷酶(R2)、内膜相关蛋白(R3)、类果糖二磷酸醛缩酶(R4)、类核糖-5-磷酸异构酶(R5)、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基(R8)、Rubisco活化酶(R12)、推定(putative)蛋白(R1),其中N16与R2与抗逆有关,R8与R12与光合作用有关,其余6个功能未知。以上研究结果表明:1)Pe DWF4和Pe CPD虽然都在BRs的生物合成中起重要作用,但在调节植物生长发育方面它们的作用并不完全相同;2)在调节植物生长发育方面Pe DWF4的作用与At DWF4的作用也可能存在差异;3)在不同的生长发育阶段或组织器官中,Pe DWF4和Pe CPD可能存在复杂的协同或拮抗作用。关于Pe DWF4和Pe CPD作用及其互作的详细机理有待于进一步研究。