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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染在世界范围内广泛流行,它是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原体。PCV2据报道可造成猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)及繁障碍等疾病,这些疾病也被统称为PCV2系统性疾病(PCV2 systemic disease,PCV2-SD)。PCV2感染在临床上主要体现为断奶仔猪多系统衰竭综合征与其他继发病症状,如体重逐渐下降、呼吸困难、贫血、腹泻和黄疸;微观病变包括淋巴结病、肾炎、胰腺炎、肝炎和肉芽肿性间质性肺炎。PCV2致病机理主要与病毒对宿主造成的免疫抑制有关,病毒感染单核/巨噬细胞系,并持续寄居于巨噬细胞和树突状细胞,通过血液循环使病毒扩散至全身,最终导致发病。在PCV2感染期间,宿主细胞DNA复制调节因子也参与调节病毒DNA的复制,病毒随细胞分裂增殖而繁殖,因而病毒的生命周期受到宿主细胞因子的调节。同时,宿主细胞也受到病毒干扰导致多种调节信号发生改变,包括细胞自然凋亡、自噬的启动和细胞因子的变化等;细胞因子的变化影响宿主的抗病毒反应。猪发生PCV2-SD后,细胞因子mRNA表达模式发生了改变,IL-10mRNA在胸腺内过表达,IFN-γ mRNA在扁桃体内过表达。在其他淋巴组织内,IFN-γ和IL-10表达量升高,IL-12p40,IL-4和IL-2mRNA表达量则减少。迄今为止,对这些生物学过程的发生机制知之甚少,如IL-10的表达调控,已经发现IL-10和多个miRNA之间存在着反馈调节机制。miRNA是来自非蛋白质编码基因的大量内源性小RNA,长度在17-25 bp左右。主要在基因转录后通过抑制mRNA翻译或诱导其退化调节蛋白编码基因的表达。1个miRNA可调节多个基因的表达,而每个哺乳动物可产生超过1000个miRNA,这些miRNA通过与靶mRNA互补位点,尤其是非翻译区域(UTRs)结合,可介导哺乳动物约30%蛋白编码基因的沉默。有试验证明宿主miRNA通过结合病毒或宿主自身编码基因mRNA,创造利于病毒生存的条件,造成病毒免疫逃逸或抑制病毒感染。目前,对于PCV2相关miRNA的报道较少,深入研究PCV2复制相关miRNA在病毒复制及致病中的作用,有利于进一步阐明PCV2与宿主的互作关系,为研发新型抗PCV2药物提供新的靶点和策略。为探索PCV2复制相关的miRNA,本试验首先分离得到1株PCV2毒株并命名为2015JS,利用适合PCV2复制表达的PK15细胞系建立感染模型,通过高通量测序筛选可能与PCV2复制有关的miRNA。然后通过研究miRNA与PCV2复制与表达之间的相互关系及分子机制,阐明miRNA在PCV2-宿主相互关系中的作用。主要包括以下3个方面的研究:1.PCV2毒株的分离鉴定及全基因序列分析临床PCR检测为猪圆环病毒2型(PCV2)阳性的病料用于病毒分离,通过PCR、间接免疫荧光试验(IFA),对所分离的病毒作初步鉴定,并测定分离株TCID50。应用PCR特异性扩增出该分离株的全基因组,经测序后进行同源性比较和系统进化分析,确定分离到1株PCV2毒株,全基因组长度为1766bp,命名为2015JS株,分离株在PK15细胞的TICD50为10-5.50,与乌拉圭毒株Uy99(GenBank登录号:KP867050)的同源性最高(99.8%),同属PCV2d型。该毒株的分离为江苏地区PCV2的流行病学研究、遗传变异分析及相关疫病的防控提供了参考资料,也为PCV2疫苗毒株提供了选择依据。后续试验所用毒株即为2015JS。2.PCV2复制相关miRNA的筛选及其对PCV2复制与表达的影响为分析PCV2复制相关的miRNA,试验采用PCV2感染PK15细胞系建立病毒复制细胞模型,提取感染过程中PK15细胞总RNA进行高通量测序,研究miRNA差异表达情况,结合本实验室前期研究结果,选择随病毒复制表达而逐渐增加的miRNA-98作为可能与PCV2复制相关的候选miRNA,然后在PCV2感染细胞内过表达miRNA-98(转染miRNA-98模拟物即miRNA-98 mimics),通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测PCV2 ORF2拷贝数,间接免疫荧光(IFA)观察病变细胞情况,并用蛋白印迹法(Western blot)测定Cap蛋白(PCV2主要免疫原性蛋白)的表达水平变化。结果表明,miRNA-98能够促进PCV2 ORF2复制及Cap蛋白的表达;抑制内源性miRNA-98表达可降低PCV2的复制与表达。因此,选择miRNA-98作为研究对象,研究其调控PCV2复制与表达的分子机制。3.miRNA-98调控PCV2复制与表达的分子机制依据miRNA-98已知序列,试验中通过生物信息学分析miRNA-98是否能够直接靶向PCV2基因组(即主要阅读框ORF1/2/3)。结果发现,在PCV2基因组上存在miRNA-98的可能靶位点。继续利用生物信息学分析miRNA-98可否通过靶向病毒复制相关的宿主细胞调节因子影响病毒复制与表达,发现在宿主细胞基因组上存在miRNA-98可能的靶标GANAB、ALG11和MAN2A2。将靶位点及其靶位点突变序列构建入双荧光报告基因pGL3-载体质粒中,与miRNA-98 mimics共转染细胞。双荧光素酶报告基因检测结果显示,miRNA-98并不影响报告基因pGL3-ORF1/2/3及pGL3-MAN2A2的活性,即miRNA-98不能直接靶向ORF1/2/3和MAN2A2转录产物;但miRNA-98可降低含有GANAB和ALG11的报告基因活性,且不影响靶位点突变报告基因活性,说明miRNA-98能够直接靶向ALG11和GANAB。进一步研究miRNA-98对细胞GANAB和ALG11 mRNA、蛋白表达和细胞周期的影响,发现miRNA-98过表达促进了 GANAB与ALG11 mRNA和蛋白的表达。细胞周期检测发现,试验组G1期细胞数较阳性对照组降低,而S期和G2期细胞数相对增多;抑制内源性miRNA-98则可抑制ALG11与GANAB mRNA和蛋白的表达,细胞周期分析结果与过表达miRNA-98的结果相反。推测miRNA-98参与调控细胞周期和凋亡,可能通过靶向GANAB阻碍宿主细胞膜表面N-聚糖的合成,使病毒进入胞内更为便利;并通过GANAB和ALG11影响细胞周期,延长病毒复制时间,从而促进病毒的复制与表达。