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目的口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,恶性程度高,易发生转移。羟基喜树碱(hydroxycamptothecine,HCPT)已被应用于口腔鳞状细胞癌的临床治疗,并取得较好的临床效果,但仍有部分患者对HCPT表现出耐药性。本研究的目的旨在探讨口腔鳞状细胞癌对HCPT耐药的机制,寻找能够用于个体化地预测口腔鳞状细胞癌对HCPT敏感性的生物标志物,以及为口腔鳞状细胞癌的治疗和HCPT化疗增敏提供潜在的靶点。方法1.探讨CDKL1是否参与口腔鳞状细胞癌细胞对HCPT耐药应用浓度梯度递增法筛选HCPT耐药口腔鳞状细胞癌细胞株;RIPA裂解液提取蛋白,应用Western blot检测HCPT耐药口腔鳞状细胞癌细胞中CDKL1表达;应用慢病毒基因敲除技术构建稳定敲除CDKL1的口腔鳞状细胞癌细胞;应用MTT细胞增殖实验、流式细胞术分别检测细胞增殖、细胞周期进程和细胞凋亡。2.探讨CDKL1是否通过调控内质网应激介导口腔鳞状细胞癌对HCPT耐药RIPA裂解液提取蛋白,应用Western blot检测内质网应激相关蛋白IRE1、BIP表达;应用IRE1抗体进行免疫共沉淀实验评价内质网相关蛋白IRE1和BIP的结合。应用BIP抑制剂HA15处理口腔鳞状细胞癌HCPT耐药细胞,降低内质网应激阈值,MTT实验检测HCPT处理后细胞增殖,评价降低内质网应激阈值能否增加细胞对HCPT的敏感性。在口腔鳞状细胞癌细胞中过表达CDKL1,Western blot检测细胞中IRE1、BIP表达,并用免疫共沉淀实验检测细胞中IRE1和BIP的结合;在口腔鳞状细胞癌HCPT耐药细胞中敲除CDKL1,Western blot检测细胞中IRE1、BIP表达,并用免疫共沉淀实验检测细胞中IRE1和BIP的结合,以评价CDKL1对内质网应激阈值的调控作用。3.探讨口腔鳞状细胞癌HCPT耐药细胞中CDKL1表达的调控机制应用Western blot检测测CDKL1蛋白表达,应用9RT-PCR检测CDKL1mRNA表达;应用基因克隆技术构建CDKL1启动子活性报告基因;应用萤火虫荧光素酶活性检测实验检测CDKL1启动子活性;应用定点诱变技术依次突变CDKL1启动子上可能的Sp1结合位点;应用染色质免疫共沉淀实验验证Sp1是否与CDKL1启动子结合。结果1.CDKL1过表达介导口腔鳞状细胞癌HCPT耐药应用HCPT处理对数生长期口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞,筛选出其中的耐药细胞,并通过挑选单克隆,选出2株HCPT耐药细胞株CAL-27H1和CAL-27H2。通过MTT细胞增殖实验证实,HCPT对CAL-27H1和CAL-27H2的增殖抑制程度明显弱于对CAL-27的抑制程度。选取CAL-27H1进行后续试验,将其命名为CAL-27H,将CAL-27H和CAL-27细胞接种于BALB/c裸鼠皮下,成瘤后腹腔注射HCPT,测量肿瘤的体积和质量发现,CAL-27H组肿瘤体积和质量低于CAL-27组。应用Trizol法提取CAL-27和CAL-27H两种细胞中RNA,反转录后,应用qRT-PCR评价两种细胞中CDKL1 mRNA表达水平,结果显示CAL-27H细胞中CDKL1 mRNA水平高于CAL-27细胞中;分别裂解CAL-27和CAL-27H两种细胞,提取蛋白,Western Blot检测两种细胞中CDKL1表达,结果显示CAL-27H细胞中CDKL1蛋白表达高于CAL-27细胞。将CAL-27和CAL-27H细胞进行裸鼠荷瘤实验,成瘤后,取肿瘤组织制备组织切片,进行免疫组织化学染色,标记肿瘤组织中CDKL1表达,结果显示CAL-27H组阳性着色明显多于CAL-27细胞,提示CAL-27H细胞中CDKL1表达较CAL-27细胞中表达增高。应用慢病毒感染技术,将CAL-27细胞感染Lv-shCDKLl,敲除CAL-27细胞中CDKL1,检测CDKL1敲除对CAL-27细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。MTT细胞增殖实验结果显示敲除CDKL1较不敲除CDKL1,细胞增殖能力明显减弱;细胞周期检测发现敲除CDKL1后,G0/G1期细胞明显所占比例明显增多,提示敲除CDKL1能够使细胞周期阻滞在G0/G1期;应用Annexin V/PI流式细胞学检测敲除CDKL1和未敲除CDKL1的CAL-27细胞中凋亡细胞比例,结果显示敲除CDKL1后,细胞凋亡率明显增高。通过慢病毒感染技术,在CAL-27细胞中过表达CDKL1,应用HCPT处理过表达CDKL1和未过表达CDKL1的细胞,应用检测细胞增殖,MTT细胞增殖实验结果显示,HCPT能够抑制两组细胞增殖,但对过表达CDKL1的细胞的增殖抑制程度明显弱于未过表达CDKL1的细胞。应用Annexin V/PI流式细胞学检测凋亡细胞比例,结果显示,应用HCPT能够诱导CAL-27细胞和CAL-27H细胞凋亡率增加,应用HCPT处理后,CAL-27H凋亡率较CAL-27细胞低。提示过表达CDKL1后,细胞对HCPT的耐药性增强。2.CDKL1通过内质网应激介导口腔鳞状细胞癌对HCPT耐药应用HCPT处理CAL-27细胞,提取蛋白,Western blot检测细胞中IRE1,结果显示,HCPT能够上调CAL-27细胞中IRE1表达,提示HCPT能够激活内质网应激。分别提取CAL-27细胞和CAL-27H细胞蛋白,Western blot检测两种细胞中BIP表达,结果显示CAL-27H细胞中BIP表达明显高于CAL-27细胞;此外,应用IRE1抗体进行免疫沉淀实验,结果发现,CAL-27H细胞中,免疫沉淀中BIP的量明显高于CAL-27细胞,因此,在CAL-27H细胞中BIP与IRE1结合能力更强,提示激活CAL-27H细胞内质网应激的阈值较CAL-27细胞更高。应用BIP抑制剂HA15处理CAL-27H细胞后,向细胞中加入HCPT,检测细胞增殖,结果显示,应用HA15预处理后,细胞在HCPT的作用下细胞增殖抑制程度较未用HA15预处理者更高,提示抑制BIP,降低内质网应激阈值能够增加CAL-27细胞对HCPT的敏感性。分别提取了过表达和未过表达CDKL1的CAL-27细胞蛋白,Western blot检测两种细胞中BIP表达,发现过表达CDKL1能够上调细胞中BIP的表达;应用免疫沉淀实验评价过表达CDKL1对细胞中BIP和IRE1结合的影响,结果显示过表达CDKL1的CAL-27细胞BIP和IRE1结合较未过表达CDKL1的细胞增强。而敲除CDKL1能够下调BIP,减弱BIP与IRE1结合。提示CDKL1能够使CAL-27细胞内质网应激阈值增高。3.口腔鳞状细胞癌中Sp1上调CDKL1表达本实验构建了 CDKL1启动子活性报告基因pGL3-CDKL1,将其转染至CAL-27细胞和口腔鳞状细胞癌HCPT耐药细胞CAL-27H细胞中,应用萤火虫荧光素酶活性检测试剂盒检测两种细胞中CDKL1启动子活性,结果显示CAL-27H细胞中CDKL1启动子活性较CAL-27细胞中增高。提取CAL-27细胞和CAL-27H细胞RNA,反转录后,qRT-PCR检测两种细胞中转录因子Sp1表达,结果显示在CAL-27H细胞CDKL1 mRNA水平高于CAL-27细胞;提取CAL-27细胞和CAL-27H细胞蛋白,检测两种细胞中转录因子Sp1表达,Western blot结果显示在CAL-27H细胞中CDKL1表达增高。在CAL-27细胞中过表达Sp1,检测CDKL1启动子活性,发现过表达Sp1能够上调CDKL1启动子活性;而敲除Sp1下调CDKL1启动子活性。CDKL1启动子上存在5个可能的Sp1识别位点,将各位点依次突变,检测各突变报告基因的活性,发现突变位点A和位点C能够下调CDKL1启动子活性,其中突变位点C能够阻断Sp1对CDKL1启动子活性的上调作用。结论口腔鳞状细胞癌中Sp1通过调控CDKL1启动子活性,在转录水平上调CDKLI表达。CDKL1表达增多能够通过上调BIP,上调内质网应激阈值,介导口腔鳞状细胞癌对HCPT耐药。Sp1/CDKL1/BIP能够作为判断口腔鳞状细胞癌对HCPT敏感性的潜在肿瘤标志物以及作为口腔鳞状细胞癌的治疗和HCPT化疗增敏药物研发的潜在靶点。