目的：　　 1.建立大鼠氧诱导视网膜病变模型,通过氧环境的改变诱导大鼠产生视网膜新生血管,模拟人类早产儿视网膜病变。　　 2.研究OIR大鼠视网膜组织中p16、CyclinD1和CDK4表达的变化情况,阐明p16、CyclinD1和CDK4在氧诱导视网膜病变中的作用机制及意义。　　 3.采用具有去甲基化作用的特异性甲基转移酶抑制剂5-氮胞嘧啶脱氧核苷(5-aza-CdR)进行干预,研究p16基因异常甲基化对新生血管异常增生的影响作用。　　 方法：　　 1.7日龄的健康SD大鼠随机分为实验组和对照组2组。实验组高氧诱导建立大鼠氧诱导视网膜病变模型,对照组置于正常空气环境下饲养。实验组和对照组分别于出生后12、14、17、21、26d处死取材。做视网膜铺片ADP酶染色和HE染色观察视网膜新生血管,免疫组化及免疫荧光观察p16、CyclinD1和CDK4的表达。行western blot检测p16、CyclinD1和CDK4蛋白。Realtime PCR检测p16、CyclinD1和CDK4的mRNA表达情况。　　 2.7日龄SD大鼠随机分为5-aza-CdR组和NS对照组。5-aza-CdR组幼鼠与其母鼠共同置于玻璃氧舱内5天,持续输入氧气,维持氧体积分数为(75%±2%),并于7d、9d、11d腹腔注射5-aza-CdR(0.25mg/kg)。在此高氧环境中饲养5天后,即出生后12d回到正常室内环境中饲养。NS对照组幼鼠同样与其母鼠共同置于玻璃氧舱内5天(7-12d),于7d、9d、11d腹腔注射同体积的生理盐水。两组分别于17天处死取材。做视网膜铺片ADP酶染色观察视网膜新生血管,免疫组化观察p16、CyclinD1和CDK4的表达。行western blot检测p16、CyclinD1和CDK4蛋白;Realtime PCR检测p16、CyclinD1和CDK4的mRNA表达情况。　　 统计学处理:采用SPSS11.5统计软件对数据进行统计学处理,采用独立样本t检验进行分析,所有数据资料均采用均数±标准差(-x±s)表示,P＜0.05为差异有统计学意义的标准。　　 结果：　　 一、视网膜新生血管的观察:　　 正常对照组12d时内层毛细血管丛覆盖在大部分视网膜上,仅在周边部有小片状的无灌注区,表层血管呈放射状;在14d时,视网膜血管发育进一步成熟,周边部已没有无灌注区,全部视网膜被成熟的毛细血管网所覆盖。17d时视网膜血管发育成熟。　　 实验组12d时视网膜血管管径变细,分支减少,走行僵直,出现大片无灌注区,14d时在视网膜灌注区和无灌注区交界的视网膜中周部开始出现结构紊乱的新生血管;17d、21d时观察到视网膜毛细血管密度增加,血管扩张、迂曲并有大量新生血管,视网膜新生血管的增殖达到高峰。26d时新生血管几乎完全消退。　　 NS对照组视网膜毛细血管密度增加,血管扩张、迂曲并有大量新生血管,出现点状、球形的微血管瘤样扩张,视网膜新生血管明显增殖。5-aza-CdR组视网膜毛细血管管径细,可见少量新生血管增生。　　 对照组各时间点幼鼠的视网膜组织切片中,未发现或仅在极少数切片中偶见突破视网膜内界膜长入玻璃体的血管内皮细胞核。实验组12d时突破视网膜内界膜长入玻璃体的血管内皮细胞核较少,14d时开始增多,17d、21dROP幼鼠视网膜组织明显增厚,可见大量突破内界膜的新生血管管腔。对照组与实验组相比有统计学意义。　　 二、P16在各组表达的变化:　　 免疫组化染色结果显示,正常视网膜中p16呈阳性表达。而在OIR大鼠视网膜,为弱阳性。14、17、21d时p16表达减弱,从阳性细胞数来看实验组与对照组相比差异具有统计学意义,17d时表达缺失最明显。26d时p16表达又略有增强。NS对照组视网膜p16呈弱阳性表达.而在OIR大鼠视网膜,5-aza-CdR组p16表达为阳性,阳性细胞数与NS对照组相比差异具有统计学意义。免疫荧光与免疫组化结果一致,17d时对照组视网膜可见明显的p16的阳性荧光信号,而实验组可见微弱的荧光信号。实验组较对照组视网膜神经纤维层细胞核增多。　　 Western blot检测结果显示:p16蛋白在OIR大鼠视网膜组织的表达下调。统计结果表明p16在正常大鼠视网膜组织表达量较高:OIR大鼠视网膜组织14d时p16的表达开始轻微下调;损伤17d和21d时,P16在视网膜的表达显著降低;在实验组后26d的视网膜,p16的下调性表达已发生明显回升,与7d时表达量相近。P16蛋白在NS对照组大鼠视网膜组织表达量较低:5-aza-CdR组大鼠视网膜表达量较高。IDVs的统计分析结果显示两组之间差异有统计学意义。　　 通过Realtime-PCR技术我们检测到,p16 mRNA在正常大鼠的视网膜有表达。在各时间点实验组OIR大鼠视网膜,p16mRNA的表达有不同程度的下调。12d时p16 mRNA有轻微下调;14d时下调明显,尤以17d、21d下调程度最大。到26d时p16 mRNA有所回升,但仍高于对照组。P16 mRNA在5-aza-CdR组大鼠的视网膜较低表达。在NS对照组大鼠视网膜,p16 mRNA表达明显下调。两组相比有统计学意义。　　 三、CyclinD1在各组表达的变化:　　 免疫组化染色结果显示,正常视网膜中CyclinD1里弱阳性表达。12d时CyclinD1表达减弱,14、17、21d时呈强阳性表达,实验组与对照组平均灰度值相比差异有统计学意义,17d时表达最明显。26d时CyclinD1表达又减弱。5-aza-CdR组CyclinD1呈弱阳性表达。NS对照组CyclinD1呈强阳性表达,5-aza-CdR组与NS对照组阳性细胞数相比差异有统计学意义。免疫荧光显示CyclinD1在实验组和对照组大鼠视网膜的表达部位与免疫组化结果一致。17d时对照组视网膜视网膜偶见微弱的CyclinD1的阳性荧光信号,而实验组可见较多绿色强阳性荧光信号,实验组较对照组视网膜神经纤维层细胞核增多。　　 各组大鼠视网膜CyclinD1蛋白表达的Western blot检测结果显示:正常大鼠视网膜中能够表达少量CyclinD1蛋白。在OIR大鼠视网膜,CyclinD1蛋白的表达随时间变化。CyclinD1蛋白在OIR大鼠12d时表达较正常组减弱,第14d起表达开始增强。在第17d时表达水平达到高峰,明显高于对照组。21、26d时CyclinD1蛋白表达水平有所下降,但仍高于对照组。IDVs的统计分析结果显示各组之间差异均有统计学意义。5-aza-CdR组与NS对照组大鼠视网膜CyclinD1蛋白表达的Westernblot检测结果显示:5-aza-CdR组大鼠视网膜CyclinD1蛋白的表达明显高于NS对照组,两组相比差异具有统计学意义。　　 CyclinD1 mRNA的Realtime-PCR结果表明,在正常大鼠视网膜CyclinD1 mRNA有少量表达。OIR大鼠视网膜CyclinD1 mRNA表达表达量随日龄增长逐渐增加,其变化规律与蛋白表达趋势基本一致。14d、17d、21d时CyclinD1 mRNA的表达量差异显著,26d时CyclinD1 mRNA的表达降低,但高于对照组。在5-aza-CdR组大鼠视网膜CyclinD1 mRNA有少量表达。在NS对照组大鼠视网膜CyclinD1 mRNA表达量明显高于5-aza-CdR组。　　 四、CDK4在各组表达的变化:　　 免疫组化结果显示,实验组不同日龄视网膜CDK4表达的改变:实验组新生小鼠12d时CDK4表达减弱,自14d起视网膜表达CDK4蛋白水平明显上升并超过对照组水平,至26d略有下降.但仍较对照组高。NS对照组视网膜CDK4表达微弱.而5-aza-CdR组CDK4表达为强阳性,阳性细胞数为与NS对照组相比差异具有统计学意义。　　 免疫荧光结果与免疫组化相符。17d时对照组视网膜视网膜CDK4的阳性荧光信号较弱,而实验组的荧光信号较强。DAPI染色显示,实验组较对照组视网膜神经纤维层细胞核增多。　　 Western Blot结果显示,正常组大鼠视网膜中CDK4蛋白的表达量较低,在实验组视网膜CDK4蛋白的表达在后14d、17d、21d显著增加,26d时CDK4蛋白含量有所下降,但仍高于正常组,5-aza-CdR组大鼠视网膜中检测到CDK4蛋白表达量较低,NS对照组CDK4蛋白表达量较高,IDVs的统计分析结果显示两组之间差异有统计学意义。　　 CDK4 mRNA表达结果显示:对照组大鼠视网膜CDK4 mRNA有少量表达。OIR大鼠14d时CDK4 mRNA表达开始增高,14d、17d、21d增高更为明显,26d时CDK4 mRNA表达下降,但仍高于对照组水平。5-aza-CdR组大鼠视网膜CDK4 mRNA有少量表达。在NS对照组大鼠视网膜CyclinD1 mRNA表达量明显高于5-aza-CdR组水平。　　 结论：　　 一、SD大鼠OIR模型与临床早产儿视网膜病非常相似。可做为ROP发病机制及治疗研究的动物模型。　　 二、在OIR大鼠视网膜组织,p16蛋白及mRNA的表达水平降低,CyclinD1和CDK的蛋白及mRNA表达上调。P16、CyclinD1和CDK4在OIR大鼠视网膜新生血管形成和增殖中具有一定的作用。　　 三、P16基因启动子的甲基状态可能是蛋白及p16 mRNA的低水平表达的机制之一。P16基因启动子甲基化而导致了p16基因表达水平低下,导致p16蛋白表达下调,使细胞周期调控紊乱,最终新生血管过度增殖,可能是ROP的视网膜新生血管发生的机制之一。