结直肠癌（Colorectal Cancer,CRC）是全球发病率和死亡率排名前五的常见消化道恶性肿瘤之一。尽管在外科手术和多模式的治疗中取得了显著的进展,但是进展期的存活率依旧很低。越来越多的证据表明,肿瘤的癌旁组织,作为一种中间状态,其免疫微环境中的成熟B细胞可进行抗原递呈和进一步分化成浆细胞,在对肿瘤的免疫应答起着正向作用,在结直肠癌的进展期中发挥着关键作用。如果能够对癌旁组织中的成熟B细胞进行量化,并在早期对其免疫功能加以干预,进而阻止CRC进入进展期,可有效的提高患者生存率。动态网络生物标志物（Dynamic Network Biomarker,DNB）是一种基于隐马尔可夫模型对具有时序性的基因表达网络进行数学模型构建的方法,可对具有时序性的肿瘤转移过程或其他一系列的生物学过程进行系统量化,进而检测其关键转变的临界时期,并挖掘出能影响这个关键转变的且占据网络主导优势的一群DNB分子标志物。由此,探索CRC转移前成熟B细胞的生物标志物对于在早期阻止CRC向晚期的恶化过程至关重要。为了确定这种成熟B细胞的预警生物标志物,本研究对从8个成对的多区域CRC样本中分离出的免疫细胞（CD45+）进行了单细胞Smart-seq2全长测序;并利用动态网络生物标志物（DNB）方法,分析了所获得的CRC患者I期到IV期癌旁组织中的成熟B细胞,鉴定出核心基因群并筛选出具有潜在重要功能的核心基因;最后利用基因编辑的方法,构建核心基因B细胞特异性敲除的小鼠模型。研究结果如下:1、对725个来自CRC全免疫图谱的B细胞进行单细胞转录组学分析,鉴定了6种B细胞亚型,其中一种鉴定为CD74+CD20+BCL11A+CCR7+B细胞,表现出成熟的B细胞亚型的特征。2、运用DNB的方法对成熟B细胞在CRC癌旁组织中不同阶段的单细胞转录组图谱进行DNB分析,发现DNB的峰值出现在二期,即淋巴结转移前的关键时期。此时这群DNB分子的标准差（Std）在二期显著呈现上升趋势,组内相关系数（Inpcc）在二期也呈现剧烈上升变化,组间相关系数（Outpcc）在二期达到了四个时期的波谷,表明II期是CRC淋巴结转移前的关键时期。3、进一步构建DNB相互作用网络发现,DNB分子在网络表达水平发生了翻转变化,即处于早期的一些低表达的基因群,到了进展期高表达;相反,一些早期表现为高表达的基因群,到了进展期低表达。而且本研究发现,DNB基因对DEG具有“滞后”的调控,同时DNB驱动差异基因的表达。如在Janus激酶（JAK）-信号转导和转录激活剂（STAT）通路中,由于上游DNB引发了下游差异基因表达水平的逆转,促进细胞凋亡事件的增加,进而影响成熟B细胞分化成浆细胞的能力;本研究也在抗原呈递等免疫功能上也发现了类似DNB调控下游DEG的结论。4、通过基于核心基因、差异基因、癌旁特异性和二期基因水平呈现高表达等评价标准对DNB进行综合排名表明,DHX9是基于DNB排名的II期特异性癌旁组织DNB核心基因;且DHX9及其邻接网络基因参与B细胞相关免疫功能的动态表达。在I期-III期,这群分子的网络水平上发生了逆转。通过外界的数据库进一步验证发现,DHX9和DHX家族在CRC中具有重要的预后价值,DHX9基因水平高表达表明具有较好的预后,表明DHX9作为候选基因具有进一步的研究价值。5、为了进一步研究CRC中B细胞中DHX9对其进展的影响,本研究构建DHX9B细胞特异性敲除（CKO）小鼠,目前已经获得DHX9 Flox F1代杂合子小鼠（DHX9Flox/+）。总之,本研究基于具有时序性的单细胞转录组学数据,采用DNB的方法,对结直肠癌癌旁组织成熟B细胞亚型进行了早期预警,预测了II期可作为CRC淋巴结转移前的临界时期;发现了DNB基因调控和驱动着差异基因的表达,CRC癌旁组织中成熟B细胞的DHX9还可作为CRC进展中的一个具有预后价值的生物标志物,为CRC早期干预的潜在免疫治疗靶点提供新线索。