cHL淋巴瘤是一种特殊的肿瘤,其恶性肿瘤细胞--霍奇金镜像细胞(HRS细胞)仅占肿瘤团块的大约1%,肿瘤组织中细胞成分中绝大多数为间质细胞和浸润细胞。cHL淋巴瘤属于生发中心或者后生发中心B细胞来源的B细胞淋巴瘤,具有克隆性免疫球蛋白基因重组。与其他大多数B细胞淋巴瘤不同的是,HRS细胞的免疫表型不同于任何造血细胞,几乎不表达B细胞标志。其可能的机制有多种,例如B细胞特异性转录因子的缺乏、转录抑制因子的过表达,及表观遗传学机制,都被认为对B细胞特异性基因在HRS细胞中的表达有抑制作用。HRS细胞的另一个突出特点是,多种信号通路包括核因子κB (NF-κB)、Jak-Stat、PI3K-AKT/PKB、ERK、AP1和receptor tyrosine kinases (RTK)通路,以及EB病毒相关蛋白等的异常活化维持了HRS细胞的存活和增值。而AKT/PKB通路和ERK通路的一个重要下游靶因子是FOXO转录因子家族。Forkhead蛋白以拥有高保守DNA结合区域the forkhead box为特征。FOXO是forkhead转录因子家族中被研究得最多的亚族之一。FOXO家族由四位成员组成,分别是FOXO1、FOXO3、FOXO4和FOXO6。翻译后共价修饰机制在FOXO活性的调控中起到主要的作用。蛋白激酶包括AKT/PKB、IκB kinase (IKK)、SGK以及ERK,可磷酸化FOXO蛋白,引起FOXO的核外转移和降解,从而抑制其活性。通过转录调控靶基因,FOXO发挥抑制生长,诱导分化或者凋亡及对抗过氧化损伤等作用。已知的FOXO靶基因包括细胞周期调控基因CCND2、CDKN1A和CDKN1B,前凋亡基因BIM, NOXA和FASL。成熟B细胞的存活依赖正常的BCR信号通路,后者激活NF-κB, PI3K-AKT/PKB等通路,促进B细胞存活、增殖。缺乏正常BCR的B细胞不可避免的发生凋亡。近期研究表明,激活PI3K通路或敲除FOXO1可挽救缺失BCR信号的B细胞的凋亡。【目的】FOXO家族在多种类型肿瘤中发挥着重要的抑癌作用。研究表明FOXO1表达的下调与B细胞发育和存活有关,敲除FOXO1可使缺失BCR信号的B细胞免于凋亡并持续增殖。cHL的HRS细胞没有正常的BCR信号,却能免于凋亡、并持续增殖。因此,我们假设：在成熟B细胞向cHL恶性转化中,FOXO1是否也扮演着抑癌基因的角色?【方法】我们首先用Genesifter软件分析了网络已发表的基因芯片数据,并以实时定量PCR(qPCR), Western immunoblot和免疫组化的方式验证,以期阐明FOXO1在正常B细胞及淋巴瘤中的表达水平。在低表达FOXO1的cHL细胞株中,稳定导入可诱导表达的FOXO1基因；Western immunoblot验证导入基因的表达；利用FACS等方法检测FOXO1表达对淋巴瘤细胞株增殖、存活的影响；并进一步通过qPCR验证了FOXO1靶基因对FOXO1基因功能的贡献。最后,我们用荧光原位杂交(FISH)和比较基因组杂交分析(array-CGH)检测FOXO1基因组位点在cHL中是否有拷贝数缺失等突变。【结果】利用Genesifter软件,我们比较了数据库中FOXO1、FOXO3和FOXO4在HRS细胞及正常B淋巴细胞亚群中的表达水平。在大多数B细胞亚型中,FOXO1的表达水平高于FOXO3和FOXO4,在生发中心B细胞—中心母细胞和中心细胞(CB+CC)中尤为显著。cHL淋巴瘤样本中,FOXO1的表达水平显著低于正常B细胞亚群,而FOXO3和FOXO4的表达水平在正常B细胞与HRS细胞中并没有显著的差异。为了验证基因芯片分析所得的结果,我们用定量PCR的方法检测了FOXO1和FOXO3在CD19+ B细胞,cHL细胞株和Burkitt’s淋巴瘤(BL)细胞株及其他B细胞淋巴瘤细胞株中的表达。其结果与基因芯片分析结果相一致。FOXO1在CD19+ B细胞中的相对表达水平远远高于FOXO3。FOXO1在正常B细胞中的表达水平显著高于其在cHL细胞株中的表达水平。FOXO1的mRNA水平在cHL细胞株中最低,在BL细胞株中也降低,但比cHL细胞株表达水平高。Western immunoblot结果显示,FOXO1的蛋白表达水平在正常CD19+ B细胞远高于cHL细胞株。为了排除FOXO1在cHL细胞株中的低表达水平是由于细胞株体外培养而造成的偏差,我们用FOXO1抗体染色增生的扁桃体标本和cHL标本。在扁桃体含有高密度中心母细胞的生发中心暗区(DZ)表现出强染色,同样,幼稚B细胞和记忆B细胞所在的滤泡套区follicular mantle zone (MZ)也呈现出强染色。稍弱的染色在以中心细胞为主的生发中心亮区可见。在T细胞区可见少许FOXO1阳性细胞。在32例cHL淋巴瘤样本中,31例的霍奇金镜像细胞的FOXO1表达为阴性,只有1例的霍奇金镜像细胞FOXO1呈现微弱的表达。相比之下,在HRS细胞周围的反应性细胞中,FOXO1呈强阳性表达。在20例临床结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤(NLPHL)肿瘤标本中,14例肿瘤细胞L&H细胞FOXO1染色呈阴性。为探讨FOXO1的下调在cHL肿瘤发生中的潜在作用,我们使用了一个可诱导的FOXO1(A3)ER体系,A3代表FOXO1基因的丝氨酸和苏氨酸位点分别被三个丙胺酸取代,导致FOXO1蛋白不会被AKT/PKB和SGK磷酸化,保证了FOXO1蛋白的活性。而且,FOXO1编码区与突变的雌激素受体(ER)相融合,形成特殊的他莫昔芬可激活体系。经Western immunoblot验证,稳定感染所得的L428、KMH2、L1236、UHO1和SUP-HD1都成功表达FOXO1(A3)ER。然后,我们研究了FOXO1激活后对cHL细胞株L428、KMH2、L1236、UHO1和SUP-HD1细胞生长的影响。我们发现,FOXO1激活后导致所有cHL细胞株活细胞数量显著减少。FOXO转录因子可以通过激活或者抑制靶基因的表达而抑制生长、诱导凋亡。因此,我们验证了靶基因对FOXO1基因功能的贡献。CCND2 (cyclin D2)是细胞周期G1/S转变所需的基因,在cHL中通常呈现高表达。FOXO1的激活显著抑制了CCND2在cHL细胞株的表达。另外,细胞周期抑制基因CDKN1B (p27, Kip1)则在FOXO1激活后被上调。FOXO1基因位于13q14。在探讨FOXO1表达下调机制过程中,我们在53例临床cHL标本中发现6例有13q14染色体缺失(11.3%),在5种cHL细胞株中,有4种细胞株有不同程度的13q染色体缺失。此外,我们发现针对AKT/PKB或者MEK1/2的抑制剂可部分恢复FOXO1在cHL细胞系的表达,而且这些抑制剂对FOXO1表达的促进作用与其对细胞生长的抑制作用相关。[结论]FOXO1在正常B细胞尤其是生发中心B细胞中高表达,在cHL的肿瘤成分HRS细胞中表达明显下调。FOXO1的低转录水平与染色体缺失有关。而AKT/PKB和MEK的持续活性引起FOXO1蛋白降解。在低表达FOXO1的cHL细胞系中,导入FOXO1基因可抑制肿瘤细胞生长,并引起凋亡。FOXO1对cHL肿瘤的抑制作用与其上调细胞周期抑制因子p27及下调cyclin D2的表达有关。说明FOXO1表达下调很可能是cHL恶性转化的重要一步.