论文部分内容阅读
新城疫(Newcastle disease,ND)因其高发病率和高死亡率给世界各地的家禽养殖业造成了巨大威胁,接种疫苗是防控ND最有效的措施。采用传统的鸡胚工艺生产新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)疫苗,存在SPF鸡胚供应不足、质量控制困难及规模放大受限等问题;基于细胞的贴壁培养工艺存在成本高、操作复杂和过程控制困难等缺点;而应用无血清悬浮培养工艺虽可克服上述缺陷,但存在缺乏对NDV敏感的悬浮细胞系、适于NDV扩增的无血清维持培养基及工艺不成熟等问题。针对上述问题,亟需开发基于动物细胞的NDV悬浮培养工艺及适于NDV增殖的无血清维持培养基。本文首先以实验室自主研发的无血清培养基SF201为生长及维持培养基,通过敏感细胞株筛选、病毒适应及细胞毒种制备、病毒接种条件优化,建立了无血清悬浮培养生产NDV工艺。当BHK-v002细胞生长至约9.0×106cells/mL时,用新鲜培养基将活细胞密度稀释至6.0×106 cells/mL,在MOI为0.005、TPCK-胰酶浓度为5 μg/mL条件下接种病毒,继续培养96 h后收获病毒,收获病毒液的血凝效价(HA效价)为8.5 log2HAU/25 μL,单细胞产毒量(Svy)达到1685.9virions/cell。为进一步优化培养过程,提高病毒产量,应用Design Expert软件对6种无血清培养基进行混料设计,成功筛选出无血清维持培养基BMM11,培养后收获的病毒上清液中HA效价和Svy分别达到9.5 log2HAU/25μL和3185.1 virions/cell。以8 g/L浓度的F水解物添加至BMM11培养基(BMM11-F),HA效价和Svy分别达到10.4 log2HAU/25μL和6981.5 virions/cell。为指导成分明确的无血清维持培养基的研制,考察了维持培养基BMM11及关键组分葡萄糖和谷氨酰胺对细胞生长、代谢和病毒增殖的影响。在维持培养基BMM11中病毒增殖后期葡萄糖和Gln耗竭不利于病毒的增殖和细胞活性的维持;高浓度葡萄糖所致的酸性pH环境降低病毒滴度,故应控制葡萄糖补加量;当Gln添加量为4.088 g/L时,病毒HA效价和Svy分别为 10.5 log2HAU/25 μL 和 6704.4 virions/cell,与 BMM11-F 培养基相当。本研究建立了 BHK-21细胞无血清悬浮培养生产NDV的工艺,并成功开发出适于NDV高效扩增的无血清维持培养基,为建立基于动物细胞无血清规模化悬浮培养技术的NDV生产工艺、替代目前鸡胚生产工艺提供了方案。