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目的:特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是一种以患者血小板破坏过多和生成减少为特点的自身免疫病。该病机制复杂,免疫因素在其发病过程中起着关键作用。多项研究指出CD4~+T细胞在ITP的发病过程中扮演着重要角色。槐耳是一种中药,其主要成分为多糖蛋白,具有抗肿瘤、增强免疫力、抗炎症的功效。本研究中,我们将要探讨槐耳清膏对于ITP病人中CD4~+T细胞亚群的作用。方法:(1)将Jurkat细胞系铺到96孔板,加入anti-CD3/CD28抗体活化(anti-CD3抗体:3?g/ml;anti-CD28抗体:2?g/ml),同时加入不同浓度的槐耳清膏分别刺激24、48、72h,用CCK8法测定槐耳清膏对于Jurkat细胞系增殖的影响。用瑞氏吉姆萨染色检测不同浓度槐耳清膏刺激72h后Jurkat细胞系的形态差异,确定出最佳的槐耳清膏浓度用于后续实验。分离ITP患者外周血单个核细胞(PBMC)加入anti-CD3/CD28抗体活化,加/不加3mg/ml槐耳清膏刺激72h,用流式细胞术检测该浓度槐耳清膏对ITP PBMC凋亡的影响。(2)分离ITP患者PBMC,加入anti-CD3/CD28抗体活化,加/不加3mg/ml槐耳清膏刺激72h,收集细胞和上清,利用流式细胞术检测其中CD4~+T细胞表面活化分子ICOS、CD38、CD25以及PD-1的表达。(3)分离ITP患者、健康人外周血单个核细胞,用含10%胎牛血清的RMPI1640培养基重悬,加入PMA 50ng/ml、离子霉素1?g/ml、Befeldin A 10?g/ml刺激4h,用流式细胞术检测PBMC中Th1、Th2细胞比例。(4)分离ITP患者PBMC,加入anti-CD3/CD28抗体活化,加/不加3mg/ml槐耳清膏刺激72h,收集细胞和上清,用流式细胞术检测其中Th1、Th2、Th17、Treg细胞的比例。(5)用ELISA和流式细胞术检测之前收集上清中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10等细胞因子的表达。结果:(1)与对照组相比,在刺激24、48、72h后不同浓度的槐耳清膏都可以抑制Jurkat细胞系的增殖,并且随着槐耳清膏浓度升高,Jurkat细胞系细胞活性降低,且呈浓度依赖性。在槐耳清膏浓度达到3mg/ml时,细胞的相对活力接近对照组的50%。瑞氏吉姆萨染色结果显示,对照组的细胞形态规则,边缘无破损。随着槐耳清膏浓度的提高,Jurkat细胞变大,胞膜结构变得不完整,胞浆内空泡增多。为了进一步验证所使用槐耳清膏浓度的安全性,我们用流式细胞术检测了3mg/ml槐耳清膏对于ITP外周血PBMC凋亡的影响。流式细胞术结果显示,对照组与3mg/ml槐耳组对于ITP PBMC的凋亡的影响无明显差异,说明这个浓度可以有效抑制细胞活力但对细胞凋亡无明显影响。(2)流式细胞术结果显示,3mg/ml槐耳清膏可以减少ITP患者PBMC中CD4~+T细胞表面活化分子CD25、CD38、ICOS的表达(P<0.01,P<0.01,P<0.01),但对PD-1表达的无影响。(3)流式细胞术结果显示,相较于健康人,ITP患者PBMC中Th1细胞比例更高(ns)、Th2细胞比例更低(ns),虽然二者差异无统计学意义,但Th1/Th2比值在ITP病人中明显上升(P<0.05),说明ITP病人存在Th1/Th2细胞极化失衡。用槐耳清膏处理ITP病人的PBMC后,发现可以明显下调ITP病人PBMC中Th1细胞比例(P<0.01),上调Th2细胞比例(P<0.01),从而纠正ITP病人中Th1/Th2失衡,流式微球阵列法(CBA)结果亦提示槐耳清膏处理后上清中Th1相关细胞因子明显下降。(4)流式细胞术结果显示,槐耳清膏可以上调ITP患者PBMC中Th17细胞比例(P<0.05),下调Treg细胞比例(P<0.01)。ELISA结果显示培养上清中相关细胞因子IL-17A、IL-23、IL-1β、TGF-β无明显变化。结论:槐耳清膏可以抑制T细胞增殖,部分抑制T细胞的活化。槐耳清膏可以修复ITP中Th1/Th2极化异常的状态,抑制促炎因子IL-2、TNFα、IFN-γ的分泌。我们实验研究的重点是中药槐耳清膏对于ITP外周血CD4~+T细胞亚群的影响,为槐耳清膏在ITP治疗的应用提供理论支持。