【摘 要】
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精子中携带的RNA对发育的影响越来越受到人们的关注,而在人和小鼠的相关研究中,研究人员主要把目光集中在父系跨代遗传——环境和疾病等原因会诱导精子中的RNA发生改变并把这种变化通过受精带给后代。长非编码RNA（Long non-codingRNA,lncRNA）既不同于mRNA能够编码蛋白,也不同于其他的小RNA具有较为明确的作用机制,其功能较为复杂。本研究将关注点放在奶牛精源性的lncRNA,通过
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目基金（编号:31972572）；
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精子中携带的RNA对发育的影响越来越受到人们的关注,而在人和小鼠的相关研究中,研究人员主要把目光集中在父系跨代遗传——环境和疾病等原因会诱导精子中的RNA发生改变并把这种变化通过受精带给后代。长非编码RNA（Long non-codingRNA,lncRNA）既不同于mRNA能够编码蛋白,也不同于其他的小RNA具有较为明确的作用机制,其功能较为复杂。本研究将关注点放在奶牛精源性的lncRNA,通过高通量测序技术和生物实验筛选牛精子中携带的特异的lncRNA并探究作为竞争性内源RNA（competing endogenousRNA,ceRNA）的调控作用。研究内容和结果如下:（1）通过对牛减数第二次分裂（Metaphase II of meiosis,MII）中期卵母细胞和获能精子进行转录组测序,筛选出在精子中高表达而卵母细胞中不表达的lncRNA。通过实时荧光定量PCR检测了MII期卵母细胞和体外受精（In vitro fertilization,IVF）2-cell胚胎lncRNA的表达情况,筛选出loc100847420、loc100848395和loc104971118在IVF2-cell的表达量显著高于MII期卵母细胞。利用生物信息学预测loc100847420、loc100848395和loc104971118结合的miRNA,及结合的miRNA的靶基因,初步构建ceRNA网络。（2）对lncRNA loc100847420靶向结合的bta-miR-154b的靶基因进行KEGG和GO富集分析,初步筛选UBE2V1和UBE2D3作为研究对象,并通过荧光素酶报告基因实验表明UBE2V1是bta-miR-154b的靶基因,并且bta-miR-154b可以下调UBE2V1mRNA和蛋白的水平。（3）通过预测loc100847420和bta-miR-154b的结合位点,构建loc100847420过表达载体和突变结合位点的过表达载体,并和bta-miR-154b共转染至胎牛成纤维细胞中。分别设置pc DNA3.1（+）-空/negative control mimic（对照组）、pc DNA3.1（+）-空/bta-miR-154b mimic、pc DNA3.1（+）-loc100847420野生型/bta-miR-154b mimic组和pc DNA3.1（+）-loc100847420突变型/bta-miR-154b mimic组,pc DNA3.1（+）-空/bta-miR-154b mimic与对照组比UBE2V1的mRNA的水平会显著降低（p<0.05）,而当共转染pc DNA3.1（+）-loc100847420野生型/bta-miR-154b mimic时UBE2V1的mRNA的水平和对照组差异不显著（p>0.05）但是显著高于pc DNA3.1（+）-空/bta-miR-154b mimic组（p<0.05）,而共转染pc DNA3.1（+）-loc100847420突变型/bta-miR-154b mimic则同样显著低于对照组（p<0.05）。证明loc100847420作为ceRNA通过bta-miR-154b调控UBE2V1的mRNA的水平。（4）通过体外转录获得loc100847420和突变了bta-miR-154b的结合位点的RNA,并对MII期卵母细胞注射体外转录产物。结果显示注射野生型loc100847420后卵裂率没有显著变化（p>0.05）,囊胚率显著提高（p<0.05）,并且提高了囊胚质量（p<0.05）;且注射野生型loc100847420的2-cell和4-cell时期的胚胎的UBE2V1的mRNA水平均显著提高（p<0.05）证明在胚胎中同样存在类似细胞的调控作用,并可能影响早期胚胎发育。结果表明,精源性的lncRNA loc100847420可以作为ceRNA调控UBE2V1的表达,并能影响早期胚胎的发育。
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