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第一部分 TGF-β1相关miRNA在胰腺癌中的表达 目的： 筛选Panc-1细胞、肿瘤相关间质细胞（cancer associated fibroblast,CAF）中受TGF-β1相关microRNA，探讨参与TGF-β1调控胰腺癌（Pancreatic cancer，PC）发生发展过程的相关microRNA。 方法： （1）应用microRNA芯片技术筛选出大肠癌细胞中TGF-β1相关表达差异性miRNA。 （2）以TGF-β1沉默后表达上调最为明显的microRNA为研究对象。 (3) 用Real-time PCR技术检测在外源性TGF-β1刺激下上述miRNA在Panc-1中的表达；利用外源性TGF-β1细胞因子刺激CAF细胞，检测其对CAF细胞中TGF-β1相关性miRNA表达的影响。 结果： （1）microRNA芯片技术筛选出大肠癌细胞株（LoVo,SW620和HT29）中TGF-β1相关差异性miRNA（查询号GSE453338），TGF-β1沉默后上调最明显的为miR-4723-3p、miR-324-3p、miR-4313、miR-196a-3p、miR-3691-3p。 （2）Real-time PCR检测结果显示上述5种TGF-β1相关miRNA在Panc-1细胞株中的表达，显示miR-4723-3p在Panc-1细胞中表达下降最明显。 （3）为了验证TGF-β1是否与肿瘤间质细胞的miRNA水平相关，用外源性TGF-β1刺激CAF细胞，再利用Real-time PCR检测其表达，结果显示，在外源性TGF-β1刺激下，miR-4723-3p在CAF中也明显降低。 结论 在由microRNA芯片筛选出来的与TGF-β1相关的候选miRNA中，miR-4723-3p 在Panc-1的表达最具差异性，且外源性TGF-β1能显著降低CAF中miR-4723-3p的表达水平，提示TGF-β1可能通过抑制PC肿瘤微环境中各类肿瘤细胞中miR-4723-3p的表达从而促进PC 的发生与发展。 第二部分 miR-4723-3p对胰腺癌生物学行为的影响 目的： 检测PC肿瘤微环境中miR-4723-3p的表达，利用慢病毒载体miRNA再表达技术探究miR-4723-3p 对panc-1细胞生物学行为的影响。 方法： （1）激光显微切割仪从收集的手术切除的PC新鲜组织标本中，参照Hwang的 CAF 分离方法，提取PC肿瘤微环境中的肿瘤细胞和间质细胞，免疫荧光鉴定提取的CAF细胞。 （2）Real-time PCR检测显微切割仪器提取的正常胰腺组织中导管上皮细胞和间质细胞与PC肿瘤实质细胞和间质细胞中miR-4723-3p表达的差异。 （3）Real-time PCR检测miR-4723-3p在人成纤维细胞中的表达，并与PC组织提取的CAF及胰腺癌成纤维细胞（Pancreatic stellate cell，PSC）相比较。 （4）用MTT法检测了慢病毒载体PCDH-511B/miR-4723-3p转染后对Panc-1细胞增殖能力的影响。 （5）Transwell实验检测过表达miR-4723-3p对胰腺癌Panc-1细胞侵袭能力的影响。 结果 （1）用激光显微切割仪获取了PC肿瘤微环境中的肿瘤细胞和间质细胞，以CAF蛋白表型Vimentin、α-SMA和Desmin为标志物，免疫荧光鉴定结果提示提取的CAF细胞的可靠性。 （2）与5例正常胰腺导管上皮细胞和间质细胞相比较，Real-time PCR结果显示miR-4723-3p在PC肿瘤实质细胞和间质细胞中均明显下降。 （3）与正常成纤维细胞相比，miR-4723-3p在PSC等细胞中明显降低。 （4）MTT检测结果显示PCDH-511B/miR-4723-3p能抑制PC细胞株Panc-1细胞的增殖，而对CAF的 增殖能力未见明显的抑制作用。 （ 5 ） Transwell 检 测 结 果 显 示PCDH-511B/miR-4723-3p 对Panc-1和CAF的侵袭能力均有显著的抑制作用。 结论： miR-4723-3p 在 PC 肿瘤实质细胞和间质细胞均有低表达现象，且过表达miR-4723-3p能抑制Panc-1细胞的增殖和侵袭能力。 第三部分 miR-4723-3p 的靶基因预测及临床样本的初步验证 目的： 预测miR-4723-3p靶基因并进行初步验证，揭示miRNA调控PC肿瘤微环境促进PC发生发展的分子机制。 方法： （1）运用生物信息学技术和网络资源预测miR-4723-3p的候选靶基因。 （2）转染PCDH-511B/miR-4723-3p 到Panc-1和CAF细胞中，通过Western Blot法初步验证各候选靶基因蛋白水平的表达。 （3）利用免疫组化染色来检测前面筛选的miR-4723a-3p的两个最佳靶基因SLC2A3和NR2F2在PC组织和癌旁组织的差异性表达情况。 结果（1）三大生物信息网站分别预测了miR-4723-3p的靶基因，各取前200个靶基因求得交集中共有20个靶基因。运用miR-Ontology Database数据库分析筛选出与肿瘤发生发展密切相关的靶基因，分别为 SLC2A3、ELFN2、CDH11、NR2F2、SPRY3。 （2）Western blot结果显示靶基因SLC2A3在Panc-1细胞中、CDH11在CAF细胞中表达明显降低；而NR2F2在Panc-1和CAF细胞中均明显降低；其他所预测靶基因未见明显差异。 （3）免疫组化进一步验证靶蛋白SLC2A3和NR2F2在胰腺癌组织和正常组织中的表达水平，结果显示在正常胰腺组织中SCL2A3和NR2F2表达水平较胰腺癌组织中高。 结论： PC中miR-4723-3p的表达减少导致靶基因SLC2A3、NR2F2蛋白水平增高，提示miR-4723-3p通过调控其下游靶基因的表达而影响PC肿瘤微环境和PC发生发展。 第三部分 miR-4723-3p 的靶基因预测及临床样本的初步验证 目的： 预测miR-4723-3p靶基因并进行初步验证，揭示miRNA调控PC肿瘤微环境促进PC发生发展的分子机制。 方法： （1）运用生物信息学技术和网络资源预测miR-4723-3p的候选靶基因。 （2）转染PCDH-511B/miR-4723-3p 到Panc-1和CAF细胞中，通过Western Blot法初步验证各候选靶基因蛋白水平的表达。 （3）利用免疫组化染色来检测前面筛选的miR-4723a-3p的两个最佳靶基因SLC2A3和NR2F2在PC组织和癌旁组织的差异性表达情况。 结果： （1）三大生物信息网站分别预测了miR-4723-3p的靶基因，各取前200个靶基因求得交集中共有20个靶基因。运用miR-Ontology Database数据库分析筛选出与肿瘤发生发展密切相关的靶基因，分别为SLC2A3、ELFN2、CDH11、NR2F2、SPRY3。 （2）Western blot结果显示靶基因SLC2A3在Panc-1细胞中、CDH11在CAF细胞中表达明显降低；而NR2F2在Panc-1和CAF细胞中均明显降低；其他所预测靶基因未见明显差异。 （3）免疫组化进一步验证靶蛋白SLC2A3和NR2F2在胰腺癌组织和正常组织中的表达水平，结果显示在正常胰腺组织中SCL2A3和NR2F2表达水平较胰腺癌组织中高。 结论： PC中miR-4723-3p的表达减少导致靶基因SLC2A3、NR2F2蛋白水平增高，提示miR-4723-3p通过调控其下游靶基因的表达而影响PC肿瘤微环境和PC发生发展。