异种或异体组织、器官来源的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)作为生物支架材料已经用于组织再生治疗。ECM主要由细胞以外的有形结构蛋白和无定型基质构成,这些细胞外无定型基质有利于细胞间或细胞与基质间的信息交流与黏附。本实验室前期研究发现:①SD大鼠作为异种脱细胞真皮动物来源具有更为可靠的组织学与生物力学依据;②根据真皮组织的抗原分布特点,确立了结合物理方法、低渗处理、胰酶消化法和洗涤剂漂洗的脱细胞制备工艺流程。本研究拟在前期研究的基础之上深入研究此脱细胞工艺流程对真皮的结构、成份及生物力学特性影响,从而对其作为异种来源的脱细胞真皮材料提供实验依据。此外,人尸体来源的片状(AlloDerm)与颗粒状(Cymetra)脱细胞真皮已广泛应用于真皮缺损替代治疗,软组织充填治疗,喉麻痹及窦道的治疗。Cymetra是先将干燥的AlloDerm采用改造后Zimmer网状皮制备器碾切成细条,然后在超低温下采用匀浆机将细条绞碎而成,68%的颗粒粒径分布于58μm ~ 593μm。制备的PADM外形不规则,粒径分布不集中,因此有必要改进颗粒状脱细胞真皮的制备方法。本研究采用室温条件下切割的方法,将片状ADM制备成一种新型颗粒状脱细胞真皮基质(particulate acellular dermal matrix, PADM),并结合大体观察、组织学分析、电镜技术、激光粒度分析仪和傅里叶变换红外光谱仪检测其外观轮廓、形态学、粒径分布和胶原分子结构。最后,采用一次手术的方式,将此种新型异体PADM复合自体断层皮片(split-thickness skin graft, STSG)用于大鼠全层皮肤缺损创面的修复,观察其作为真皮再生模板对全层皮肤缺损模型再生真皮组织结构与生物力学特性的影响。目的1.观察前期确立的脱细胞工艺对大鼠真皮结构、成份与生物力学特性的影响,初步阐明此工艺制备的大鼠ADM作为组织工程支架材料的特点。2.建立一种操作简单、方便的制备PADM的方法,并检测新型PADM的外形、粒径分布和胶原分子结构,探索其作为真皮再生模板的优缺点。3.研究此种新型异体PADM在体内作为真皮再生模板对大鼠全层皮肤缺损模型再生真皮组织结构与生物力学特性的影响。方法1.雄性SD大鼠8只,麻醉、备皮后,剪取背部全层皮肤,用取皮机去除皮下组织和表皮,制得网状层真皮(厚度:0.20 mm)。采用低渗溶液、0.25%(w/v)胰蛋白酶、0.5%(v/v)TritonX-100和PBS溶液对SD大鼠网状层真皮进行脱细胞处理,并以自体未脱细胞网状层真皮作为对照。分别采用组织学染色、电镜技术、荧光定量、生化和Instron 1011型材料实验机检测脱细胞前后真皮组织结构、成份(DNA、sGAG)与生物力学特性的变化。对实验数据行配对样本t检验。2.雄性SD大鼠4只,麻醉、备皮后,收集SD大鼠背部皮肤样本,采用第一部分建立的脱细胞方法制备片状网状层脱细胞真皮。将片状ADM真空干燥后,室温下切割成四种不同规格的颗粒状脱细胞真皮,并结合大体观察、组织学分析、电镜技术、傅里叶变换红外光谱仪及激光粒度分析仪检测其大体轮廓、组织形态学、胶原分子结构与颗粒粒径分布情况。并将其与人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)体外共同培养24 h,观察脱细胞真皮颗粒与HUVEC的黏附情况。3.采用随机数字表法将12只雄性SD大鼠(移植受体)分为实验组和对照组,每组6只。于两组大鼠背部正中制备面积为4 cm×6 cm的全层皮肤缺损创面,并将切除的面积为4 cm×6 cm全层皮肤用取皮机分别去除皮下组织及真皮组织,制备成厚度为0.20 mm的断层皮片备用。实验组大鼠创面采用规格为0.5 mm的新型异体颗粒状脱细胞真皮(面积扩张比:10:5)复合自体断层皮片移植覆盖,对照组大鼠创面则仅移植覆盖自体断层皮片。术后2、3、4、8、12、20周对移植皮肤行大体观察计算移植皮片成活率、创面收缩率或扩张率。术后20周取两组创周正常皮肤及创面愈合皮肤标本行组织学分析(HE与天狼星红染色)与生物力学特性检测。采用HE染色法观察胶原纤维束结构,测量胶原纤维束直径及间隙率;采用天狼星红染色法观察Ⅰ、Ⅲ型胶原的分布情况,计算Ⅰ、Ⅲ型胶原含量及其比值。采用Instron 1011型材料实验机对两组动物愈合皮肤标本行单轴拉伸试验。实验数据行t检验、Levene′s方差齐性检验、t’检验。结果1.与未脱细胞真皮比较,组织学与电镜结果显示,该脱细胞工艺在组织形态上有效的去除了原有真皮内的细胞及皮肤附件结构,且制备的ADM胶原纤维束结构保持良好,未见结构破坏、紊乱。成份定量分析显示,与未脱细胞真皮比较,脱细胞真皮内DNA含量[(0.46±0.08)μg/mg v.s. (1.91±0.18)μg/mg, (t=-29.420, P=0.000)]显著下降,sGAG的含量[(2.02±0.60)μg/mg v.s. (5.58±0.47)μg/mg, (t=-11.497, P=0.000)]保留约36%。此外,ADM含水量有所增加[(75.94±2.19) % v.s. (72.85±1.22) %, (t =-6.668, P=0.000)]。生物力学检测结果显示,与未脱细胞真皮比较,脱细胞真皮的最大应力(MPa)[(15.77±6.06) MPa v.s. (11.37±1.94) MPa, (t=-2.447, P=0.044)]显著增加,杨氏模量(MPa)[(83.81±27.46) MPa v.s. (19.93±23.62) MPa, (t=-4.633, P=0.002)]显著增加,而最大应变(mm/mm)[(0.32±0.05) mm/mm v.s. (0.41±0.08)mm/mm, (t =4.170, P=0.004)]显著下降。2.制备的新型PADM外观为白色颗粒,HE染色后显微镜下观察显示颗粒内部胶原纤维束结构疏松。扫描电镜显示其外形近似于长方体或立方体,颗粒断面结构疏松。透射电镜显示胶原原纤维的周期性横纹结构和均匀分布的胶原原纤维间隙。激光粒度分析仪检测显示其颗粒的粒径分布集中,例如,规格为0.2 mm的PADM,其80%(d0.1 ~ d0.9)的粒径分布于233~487μm。FTIR结果显示,PADM分别在1659, 1549和1239 cm?1处出现的特征吸收峰表明其保留了胶原分子的α-螺旋(α-helix),β-片层(β-sheet)和β-转角(β-turn)二级分子结构。且体外HUVEC较易黏附于PADM。3.大体观察结果显示,术后2周,实验组大鼠创面移植皮片成活率[(76.05±13.07)%]显著低于对照组[(94.51±1.31)%, (t’=3.440, P=0.018)]。术后3周,实验组创面收缩率[(34.14±7.54)%]显著大于对照组[(15.62±11.96)%,(t =-3.211, P=0.009)]。术后8周,两组创面扩张率接近一致[(-6.22±14.16)% v.s. (-5.78±16.13)%,(t=0.050,P=0.961)]。术后20周,HE染色和天狼星红染色显示,与同时相点的大鼠创周正常皮肤比较,对照组再生真皮的胶原纤维束呈均质化改变,胶原纤维纤细,排列紊乱;实验组再生真皮的胶原纤维束结构、排列更接近于创周正常皮肤结构,同时可见少量未完全降解的异体PADM。组织学定量分析结果显示,与对照组相比较,实验组再生真皮的胶原纤维束更粗[(9.61±0.82)μm v.s. (7.26±1.39)μm, (t= - 3.562, P=0.005)] ,间隙率更高[(23.82±5.00)% v.s. (16.94±4.17)%, (t=-2.760, P=0.020)],且Ⅰ/Ⅲ型胶原比例更高[(4.31±1.15) v.s. (2.33±0.98), (t =-3.204, P=0.009)]。实验组再生真皮的上述胶原结构指标更接近于创周正常皮肤水平。术后20周,实验组皮肤样本最大应力(MPa)[(12.74±5.66) MPa v.s. (8.93±3.70) MPa,(t=-1.378,P=0.198)]与杨氏模量(MPa)[(80.38±37.29) MPa v.s. (51.42±18.53) MPa,(t’=-1.703,P=0.130)]均高于对照组,但无统计学差异。两组的最大应变(mm/mm)较为接近[(0.36±0.04) mm/mm v.s. (0.40±0.05) mm/mm,(t=1.233,P=0.246)]。结论1.本实验室确立的脱细胞制备工艺能有效降低真皮内DNA残留量,保留真皮内较多的sGAG含量,虽然对SD大鼠真皮组织结构影响较小,但是仍显著改变了ADM的某些生物力学特性。2.建立了一种PADM的制备方法,该方法操作简便,制备条件温和。制备的PADM形态规则,粒径分布集中,胶原纤维束结构及胶原原纤维的分子结构保存良好。3.新型异体PADM在体内作为创面修复的真皮再生模板,有助于提高自体断层皮片修复大鼠创面再生真皮组织的成熟度,并在一定程度上改变了愈合皮肤组织的生物力学特性。