在当今世界范围内,猪呼吸道疾病综合征(PRDC)给现代集约化养猪业造成了严重的经济损失。其中由细菌继发感染导致的发病占据相当的比例,因此对发病猪群进行呼吸道细菌性病原的分离鉴定及药敏试验对猪呼吸道疾病的诊断及临床用药具有重要的参考意义,同时亦可为后续的研究提供实验材料和研究依据。当前对我国猪群危害严重的细菌病是猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病。猪链球菌是一种重要的人畜共患病原,可以引起猪和人类的多种疾病。目前,根据荚膜抗原特异性,猪链球菌可以分为33个血清型,研究表明其血清型与致病性具有一定的相关性。副猪嗜血杆菌病是当前我国猪群的头号细菌继发感染性疾病,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。多杀性巴氏杆菌在猪群的感染也非常普遍,由产毒素性多杀性巴氏杆菌(toxigenic Pasteurella multocida,T+Pm)感染导致的猪萎缩性鼻炎(Swine atrophic rhinitis,AR)是一种世界性的猪病。由T+Pm分泌产生的多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)是萎缩性鼻炎的主要致病因子,单独接种PMT可以在试验猪体内复制AR的所有主要症状。该毒素是一种蛋白质,分子量约为146kDa,针对PMT蛋白及其抗体的检测是目前诊断AR的重要手段。因此,通过制备针对PMT的单克隆抗体建立检测PMT的免疫学方法具有重要意义。详细研究如下:1.猪呼吸道疾病综合征细菌性病原的分离和猪链球菌血清型鉴定对江苏、浙江、山东、广西、山东等省送检的84份肺脏、脾脏等病料组织进行了细菌分离和培养,通过对菌落进行形态学、染色特性鉴定,将疑似菌株用种特异性引物进行PCR鉴定或用16S rRNA基因通用引物PCR扩增后进行测序鉴定。一共分离到如下菌株:35株猪链球菌、13株副猪嗜血杆菌、10株多杀性巴氏杆菌、7株支气管败血波氏杆菌、3株传染性胸膜肺炎放线杆菌。其中猪链球菌是最主要的病原,通过多重PCR技术对本实验分离到的35株猪链球菌进行分型,血清型分布如下:除了 2株不能分型外,其余分别为2型、9型、16型、8型、3型、29型、25型、31型、4型、18型,所对应的细菌数量分别为5株、3株、1株、2株、1株、1株、1株、1株、1株、1株,其中2型和9型为优势血清型。2.猪呼吸道疾病综合征细菌的耐药性分析采用Kirby-Bauer(K-B)纸片扩散法,对35株猪链球菌、13株副猪嗜血杆菌和10株多杀性巴氏杆菌进行耐药性分析,结果显示所分离到的猪链球菌对头孢噻肟和青霉素较敏感,敏感率分别为97%和94.3%,其次为阿莫西林,敏感率为86%,所分离到的猪链球菌对林可霉素、卡那霉素和四环素表现出较高的耐药率,耐药率分别为86%、77.2%和78%,对甲氧苄啶的耐药率为62.8%。多重耐药性结果显示只有1株SS对以上11种抗生素全部敏感,其中耐4种和3种抗生素的细菌最多,分别为11株和10株,耐7种、6种、5种、2种、1种抗生素的SS分别为1株、1株、6株、3株、2株。HPS对氟苯尼考和恩诺沙星的敏感性最强,敏感率均为100%,其次为阿莫西林和多西环素,敏感率均为92.3%。HPS耐5种抗生素的有3株,耐4种抗生素的有1株,耐3种抗生素的有2株。10株巴氏杆菌绝大多数对头孢噻肟、青霉素G和阿莫西林较敏感,而对林可霉素、磺胺异噁唑不敏感,同时获得一株具有磺胺药物耐药性的菌株LH4。对LH4进行质粒提取,获得一个同时携带链霉素和磺胺抗性基因strA和sulⅡ的质粒 pLH4。3.多杀性巴氏杆菌毒素单克隆抗体的制备及初步鉴定为了建立检测产毒素型巴氏杆菌的免疫学检测方法,以原核表达并纯化后的重组PMT蛋白免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术,通过数次亚克隆以及间接ELISA方法的筛选过程,制备并鉴定出3株能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3E3、5G6和2H4。Western blot结果证明这3株单克隆抗体均能够与重组PMT和T+Pm发生特异性反应。单抗3E3、5G6和2H4的细胞上清效价分别为1:3200、1:3200和1:6400。传代培养至20代时,检测分泌的抗体效价基本一致,说明三株杂交瘤细胞株能够连续传代并且稳定分泌抗体。单抗亚类鉴定结果表明单抗5G6和3E3属于IgG1亚类,2H4属于IgG2a亚类,3株单抗轻链均为κ型。相加实验证明3株单抗的抗原识别位点相同。