柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing，HLB）又称黄梢病、黄枯病、青果病，是世界柑橘生产上最具毁灭性的一种系统性病害。迄今，HLB已危害到了亚洲、非洲、南美洲和北美洲的40多个国家的柑橘产业，在我国南方地区，柑橘黄龙病的蔓延甚至已经导致部分地区柑橘产业的毁灭。HLB病原是一种专性寄生于韧皮部筛管细胞内、难培养的革兰氏阴性细菌，属于变形菌门（Proteo-bacteria），α-变形菌纲（Alphaproteobacterial），韧皮部杆菌属（Liberibacter）。柑橘黄龙病主要通过柑橘木虱和带菌接穗苗木进行传播，由于全球变暖，柑橘木虱分布范围扩大，病发柑橘产区面积亦有扩大趋势。柑橘黄龙病为积年流行病害，植株感病后潜伏期长，流行速度相当迅速，由此柑橘黄龙病的早期正确诊断对于病害的防治意义重大。　　有关黄龙病的检测诊断、检测方法经历了从传统生物学方法检测到分子生物学检测、从只能定性检测到定性基础上的定量检测的发展过程。20世纪90年代后，随着PCR技术广泛进入检测检验领域，黄龙病由于难于获得纯培养，利用PCR方法检测几乎成为唯一通用的办法，已经有了利用常规PCR、实时荧光定量PCR以及巢式 PCR检测柑桔黄龙病菌的相关报道。本研究利用A.Hocquellet依据rplKAJL-rpoBC基因族序列所设计的能够区别扩增柑橘黄龙病菌亚洲种和非洲种引物对A2和J5建立了新的巢式PCR检测方法，并将该方法与目前较为通用的常规PCR方法和实时荧光定量PCR方法进行比较，分析比较常规PCR、SYBR GreenⅠ荧光定量PCR和巢式PCR三种检测体系对柑橘黄龙病菌检测的特异性、灵敏性、准确性和实用性等各项参数；并采用巢式PCR和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR对广西定点柑橘园疑似柑橘黄龙病样品进行实际检测，比较了两种检测体系的阳性检出率。以期为柑橘黄龙病早期诊断、病原菌动态监测的检验检疫方法的选择提供参数依据。　　由于HLB病原菌为革兰氏阴性难培养菌，尚无法人工分离培养，国内外虽有少数几则柑橘黄龙病菌体外成功培养的相关报道，但并没有获得认同。目前的技术攻关主要集中于柑橘黄龙病菌与其寄主植物内生菌的共培养，揭示黄龙病菌与内生细菌之间的中相互作用，有利于黄龙病菌体外人工培养的研究。本研究从Genbank中筛选柑橘黄龙病罹病植株伴生细菌16S rRNA基因序列，进行生物信息学分析；并根据引物和探针的设计原则寻找不同细菌种属间的保守片段，设计筛选适合实时荧光定量PCR检测的细菌通用引物和能区分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的分型探针；构建能够有效区分罹病柑橘样品及混合培养体系中革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的实时荧光定量PCR双色检测体系并优化扩增条件，以期为柑橘黄龙病菌混合培养及黄龙病菌与寄主植物内生菌之间的互作关系提供有效方法。　　研究所获得主要结果如下：　　①本研究采用能区别性扩增柑橘黄龙病亚洲种和非洲种的A2/J5引物对为外侧引物，CQULA03F/CQULA03R为内侧引物，构建了柑橘黄龙病菌巢式 PCR检测方法体系，体系灵敏度约为常规PCR的104倍可达100ag·μL-1。　　②对来自广西合浦的425个疑似柑橘黄龙病样品采用巢式 PCR和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法进行检测，对疑似样品的阳性检出率分别为46.6％、40.0％，二者的符合度大于85.8%，说明巢式PCR可以有效检测出田间的柑橘黄龙病，但灵敏度略低于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR。　　③柑橘黄龙病疑似样品的监测体系的灵敏性依次为SYBR GreenⅠ荧光定量PCR>巢式PCR>常规PCR；巢式PCR由于有两对引物进行两次扩增反应，特性优于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR和常规PCR。　　④设计了用于实时荧光定量PCR检测的细菌通用引物2对，筛选出1对适用于双重定量PCR反应细菌通用引物；设计了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的特异性探针各一对；选用黄龙病菌特异引物和特异探针各一对；优化了检测反应体系的反应条件，构建了监测混合共培养体系中柑橘黄龙病菌和伴生菌、罹病柑橘植株内柑橘黄龙病菌与共生细菌革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的双色实时荧光定量PCR体系。为监测罹病柑橘植株内生细菌与黄龙病菌互作动态变化，筛选对黄龙病菌促进或抑制的内生细菌菌株以及为柑橘黄龙病菌人工体外培养技术支持。