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研究背景肿瘤扩散的重要机制之一是肿瘤细胞离开原发部位,通过淋巴系统转移到淋巴结。近年研究证实,肿瘤诱导的淋巴管生成促进了癌细胞的转移性扩散,导致肿瘤患者预后差、生存率低。多项研究发现血管内皮生长因子(VEGF)-C和-D是最重要的两个淋巴管生成因子,它们通过结合淋巴管内皮细胞(LEC)上的血管内皮生长因子受体(VEGFR)-3,继而促进LEC增殖、迁移和管状结构形成,从而诱导淋巴管生成。大量临床病理研究证实,在多种人类肿瘤中,如非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、结肠癌等实体肿瘤,VEGF-C表达与微淋巴管密度(LMVD)、淋巴管侵袭(LVI)、淋巴结转移密切相关。多种化学诱导的肿瘤模型、转基因模型和移植瘤模型实验证实VEGF-C过表达可促进肿瘤淋巴管生成、区域淋巴结转移甚至远处转移。因此,深入探讨VEGF-C表达调控,以抑制VEGF-C表达,阻断淋巴管生成,最终改善恶性肿瘤患者的预后,具有重要的理论意义和临床应用前景。与VEGF-A相似,多种炎症信号和分子如低氧、环氧化酶-2(COX-2)、促炎细胞因子白介素1-β(I1-β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等通过自分泌和旁分泌的机制上调VEGF-C mRNA和蛋白在不同类型细胞中的表达。然而,既往的研究多局限于核因子-κB(NF-κB)等转录水平对VEGF-C的调控,对其在转录后水平的调控尤其是在肿瘤细胞中的调控和机制尚不清楚。人抗原R (HuR)是胚胎致死视觉异常(ELAV)家族的RNA结合蛋白,最初发现HuR与神经分化有关。近年研究发现HuR是调节mRNA稳定性的重要RNA结合蛋白。研究证实,在细胞外信号的作用如炎症因子、激素和生长因子等刺激下,HuR可在细胞核和细胞浆之间穿梭,导致胞浆中的HuR蛋白量增高,并通过RNA识别基序(RRM)与多种mRNA 3’端未翻译区(3’UTR)的富含AU碱基的序列(ARE)结合,使mRNA从胞核转运至胞浆的过程中保护mRNA免受核酸酶降解,从而增加mRNA的稳定性。多种分子的mRNA,如介导细胞增殖的细胞周期蛋白cyclin A、cyclin B,细胞因子TNF-α、IL-6和IL-8,以及VEGF-A和COX-2的mRNA含有ARE,均受ARE结合蛋白调控(AUBP),包括增加mRNA稳定性的HuR和促进mRNA降解的AU结合因子-1(AUF-1)。但HuR是否也调控了VEGF-C表达,目前尚不清楚。体内外研究发现,HuR不仅在多种人类肿瘤组织和细胞中高表达,而且证实胞浆HuR阳性而不是胞核HuR阳性与乳腺癌和直肠癌等预后相关。但目前尚未见HuR与肺癌关系的报告。最近研究发现,胞浆HuR阳性并与乳腺癌ER阴性、PR阴性和淋巴结转移密切相关。这些研究提示HuR可能参与了淋巴结转移过程,但具体机制尚不清楚。目的研究HuR与VEGF-C表达在肺癌中的关系,并进一步探讨HuR调控VEGF-C mRNA稳定性的分子机制,为寻找新的抗肿瘤淋巴管生成分子靶点提供实验依据。方法1.免疫组织化学法检测HuR和VEGF-C蛋白在81例NSCLC组织和15例肺良性病变组织中的表达,并分析肿瘤胞浆、胞核HuR表达分别与VEGF-C表达、肿瘤分期、分化程度及淋巴结转移等的关系。2.以Lewis肺癌(LLC)细胞为主要体外模型,应用Western blotting、定量RT-PCR和ELISA方法检测IL-1β刺激LLC细胞表达VEGF-C蛋白和mRNA的时间和剂量效应关系。3.利用放线菌素D(ActD)脉冲追踪实验观察IL-1β上调VEGF-C表达是否与其mRNA稳定性增加有关。4.构建HuR干扰载体pGenesil-siHuR,通过siRNA干扰HuR表达,以明确HuR在IL-1β增加LLC细胞VEGF-C mRNA稳定性中的作用。5.构建HuR真核表达载体,体外分析高HuR水平对IL-1β刺激LLC细胞表达VEGF-C的影响。6. MTT实验和Transwell实验分别分析HuR过表达对IL-1β诱导LLC细胞生长和迁移的影响。7.用C57BL/6小鼠,建立高表达HuR和非高表达HuR的LLC皮下移植瘤模型;分析高HuR水平对移植瘤生长、VEGF-C表达、淋巴管生成、淋巴结转移和肺转移的影响。8. Western blotting和定量RT-PCR分别检测高表达HuR的LLC移植瘤、对照组移植瘤VEGF-C蛋白和mRNA的表达情况。9.利用免疫荧光和共聚焦显微镜观察IL-1β刺激肺腺癌细胞后HuR蛋白在胞核-胞浆的转运,并进一步分析p38 MAPK通路在调控HuR转运中的作用。10.构建荧光素酶报告基因载体,通过双荧光报告基因检测试剂盒、RT-PCR分析含有ARE的VEGF-C 3’UTR在调控mRNA稳定性中的作用,并进一步分析不同ARE区域调控mRNA稳定性的差异。结果1. 81例NSCLC的HuR胞浆阳性表达率、HuR胞核阳性表达率、VEGF-C阳性表达率分别为45.7% (37/81)、82.7% (67/81)和70.4% (57/81),与肺良性病变组织比较均有显著性差异(P < 0.01)。VEGF-C表达与淋巴结转移(P < 0.01)和NSCLC临床分期密切相关(P < 0.01),但与患者性别、年龄、组织学类型和组织分化程度均不相关(P > 0.05)。胞浆HuR表达水平与淋巴结转移(P < 0.01)、分化程度(P < 0.05)和pTNM分期密切相关(P < 0.05),但与患者的性别、年龄和肺癌组织学类型无明显关系(P > 0.05)。胞浆HuR高表达(P < 0.05)而不是胞核HuR高表达(P > 0.05)与VEGF-C的表达呈正相关。2.随着IL-1β浓度(0-20 mg/ml)增加,LLC细胞胞浆VEGF-C蛋白和mRNA以及分泌的VEGF-C水平显著上调,刺激后12 h达最高值。3. IL-1β诱导VEGF-C表达与VEGF-C mRNA稳定性增加密切相关。4.成功构建了pGenesil-siHuR干扰载体;载体转染LLC细胞下调了HuR表达,继而阻断了IL-1β诱导的VEGF-C表达并降低了VEGF-C mRNA稳定性。5.成功构建了HuR真核表达质粒pEGFP-HuR;质粒转染LLC细胞增加了IL-1β诱导的VEGF-C表达。6. Transwell和MTT实验结果显示,HuR过表达增加了LLC细胞迁移,促进了细胞生长。7.动物实验分为pEGFP-N1/LLC组和pEGFP-HuR/LLC组。小鼠皮下移植LLC后30 d,比较pEGFP-N1对照组(n = 6)同侧颈上、对侧颈上及腋窝淋巴结转移率为分别为100%、83.3%和33.3%,而pEGFP-HuR组分别为100%、66.7%和100%。同侧颈上和对侧颈上淋巴结转移率两组间无统计学差异(P > 0.05),但pEGFP-HuR组腋窝淋巴结转移率明显高于对照组(P < 0.05),分别为100%和33.3%。两组双肺转移结节数分别为(6.5±2.1)和(10.7±2.4),具有统计学差异(P < 0.05)。HuR过表达组移植瘤LMVD为19.7±2.4,显著高于对照组(13.2±2.8) (P < 0.05)。8. Western blotting和定量RT-PCR结果显示HuR过表达的LLC移植瘤VEGF-C蛋白和mRNA水平显著高于对照组。9.免疫荧光和共聚焦显微镜及Western blotting结果显示,IL-1β增加了HuR蛋白在胞浆中的聚集。10. p38 MAPK特异性抑制剂SB352038阻断了IL-1β诱导的HuR胞核-胞浆转运和VEGF-C表达,并降低了VEGF-C mRNA的稳定性和VEGF-C表达。11.成功构建了荧光素酶报告载体pGL3-VEGF-C 3’UTR、pGL3-VEGF-C 3’UTR1、pGL3-VEGF-C 3’UTR2和对照载体pGL3-VEGF-C CR。12.定量RT-PCR和双荧光素酶报告基因检测结果表明,与pGL3-VEGF-C CR转染组比较,pGL3-VEGF-C 3’UTR转染组荧光素酶mRNA水平和荧光素酶活性显著降低。进一步发现pGL3-VEGF-C 3’UTR2转染组荧光素酶mRNA水平和荧光素酶活性低于pGL3-VEGF-C 3’UTR1转染组。结论IL-1β通过增加mRNA稳定性诱导肺癌细胞表达VEGF-C,促进了淋巴管生成和淋巴结转移。VEGF-C 3’UTR2是调控mRNA稳定性的主要序列。RNA结合蛋白HuR通过IL-1β激活的p38 MAPK通路从胞核转运至胞浆,并与3’UTR结合增加了VEGF-C mRNA的稳定性。