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溶菌酶是一种碱性蛋白酶,主要通过破坏细菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4糖苷键,从而使细菌因为肽聚糖细胞壁的“散架”而死亡。研究发现,海参i-型溶菌酶具有较广泛的抑菌谱,具有较高的应用价值和应用范围。(1)本课题首先研究了海参i-型溶菌酶的高效表达,将实验室已经在基因水平上进行优化的三种海参i-型溶菌酶基因,进一步构建成三种毕赤酵母基因工程菌,即:工程菌一号(pPIC9K-Sj Lys/GS115),工程菌二号(pPIC9K-Sj Lys-HisN/GS1 15)和工程菌三号(pPIC9K-opt-Sj Lys/GS115),目的是筛选出高产溶菌酶蛋白的生产菌株。首先从大肠杆菌中提取表达质粒,即:pPIC9K-Sj Lys(工程菌一号质粒)、pPIC9K-Sj Lys-N(工程菌二号质粒)和pPIC9K-opt-Sj Lys(工程菌三号质粒),然后用内切酶Bgl Ⅱ线性化,再通过电转化法将质粒分别转入毕赤酵母菌株GS115中,构建出三种毕赤酵母基因工程菌,再利用MD平板进行组氨酸缺陷型筛选,进一步经G418抗:性筛选高拷贝转化子,甲醇诱导摇瓶发酵,后经SDS-PAGE凝胶电泳筛选高产菌株,并进行抑菌圈实验进一步验证其活性。实验得到1株能高效表达海参i-型溶菌酶的菌株,命名为HS1-1。(2)其次将海参i-型溶菌酶作为饲料添加剂饲喂海参。考察海参i-型溶菌酶对海参生长、免疫等方面的影响。实验对照组一:投喂饲料:对照组二:投喂饲料和益生菌;实验组:设置了五个溶菌酶梯度(1000～5000U/kg)。对海参生长情况进行比对,分别检测其体内的超氧化物歧化酶,碱性磷酸酶,酸性磷酸酶以及溶菌酶进,进行对比分析。结果表明,添加了 4000U/kg溶菌酶的实验组,海参生长性能最优,体重增加最多,且其免疫酶活性相对最高。通过实验得出初步结论,以溶菌酶和益生菌饲喂海参的最佳浓度为4000U/kg和1*108cfu/g,饲喂时间为45d时,海参体内与免疫和抗氧化相关的酶活性达到最高,以后趋向稳定。本课题的研究不仅对后期溶菌酶放大发酵试验提供了有力的物质基础,更是对海参i-型溶菌酶的应用提供了理论基础和实验依据,具有较高的研究价值。