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铜绿假单胞菌是一种重要的条件致病菌,在临床上常常引起难治性和顽固性感染。众多毒力因子的产生和存在是铜绿假单胞菌具有感染性和致病性的重要因素,生物被膜的形成是其产生耐药性的一个重要原因。鞭毛是铜绿假单胞的主要运动器官和重要的毒力因子,由其介导的泳动能力在生物被膜形成的早期和维持生物被膜正常的结构中起着重要的作用。本文以一株临床分离株Pseudomonas aeruginosa PA68作为出发菌株,采用突变分析、遗传互补、同源重组、酵母双杂交、微阵列DNA芯片等方法系统地研究了pfm基因的功能,为揭示菌体泳动机理、探索能量代谢途径,预防和抑制生物被膜的早期形成,抑制毒力因子的释放提供实验依据,为药物设计提供新的靶位点。
对pfm突变株的运动表型进行检测,发现其泳动能力丧失,通过导入携带完整pfm基因的表达质粒可以使pfm突变株的泳动能力基本恢复至野生型水平,首次发现pfm基因是一个泳动能力相关的基因。利用同源重组的方法,在模式菌株P.aeruginosa PAK中进行pfm基因置换,得到的基因敲除株具有同样的表型,从而证实了pfm基因的功能与细菌的泳动能力相关。在透射电镜下观察到pfm突变株的鞭毛是完好的,说明pfm基因并非鞭毛的结构基因也不影响鞭毛的正常组装。在相差显微镜下可以观察到pfm突变株均具有正常的细胞形态,然而,与运动活跃的野生株相比,pfm突变株在液体环境中是无运动性的,即突变株的鞭毛是完好的但无法旋转,说明pfm基因的功能可能是参与细菌鞭毛的旋转。
在铜绿假单胞菌基因组中,pfm基因与两个能量代谢相关基因etfA和etfB相邻并同属一个操纵子,etfA和etfB基因分别编码电子传递黄素蛋白(ETF)的α亚基和β亚基。利用酵母双杂交系统研究pfm基因表达产物PFM蛋白与ETF蛋白之间的相互作用,首次发现铜绿假单胞菌的电子传递黄素蛋白在体内是以αβ异源二聚体的形式存在的,pfm基因编码蛋白PFM能够和ETF结合,结合位点位于ETF的α亚基中。对PFM蛋白的氨基酸序列进行BLASTP和多重序列比对发现,PFM蛋白与大量的细菌短链乙醇脱氢酶有很高的相似性,并具有保守的NADP辅酶结合位点,在铜绿假单胞菌中,pfm基因编码产物可能是一种依赖NADP的短链乙醇脱氢酶。
通过DNA芯片的方法得到了pfm突变株的基因表达谱,与相同背景的野生型菌株对比分析发现,pfm基因的失活能够影响全基因组的表达,pfm基因的表达产物可能是一个广泛作用的,具有重要功能的蛋白质,而不仅仅是某一条生物学途径中的成员或调节因子。在表达量发生变化的基因中参与主动运输、能量代谢功能的基因最多,并发现在突变株中由于pfm基因的失活,一些Ⅰ型和Ⅱ型蛋白分泌系统基因的转录水平大幅下降,导致某些由质子动势驱动的主动运输途径严重受阻,通过测定pfm突变株中Ⅱ型分泌系统依赖的弹性蛋白酶LasB的分泌验证了转录分析的结果,首次发现pfm基因是一个细菌蛋白分泌系统相关基因。
本文推测铜绿假单胞菌的pfm基因表达产物可能是一种脱氢酶,它作用于某种或多种还原剂,释放质子(H+)同时将电子传递给黄素蛋白(ETF),形成电子传递链,电子传递导致质子从胞内向胞外移动,电子向内传递,结果形成质子动势。铜绿假单胞菌细胞利用质子动势来驱动蛋白质分子的跨膜运输和鞭毛的旋转。
通过对pfm基因表达产物的酶活特性、蛋白质结构、蛋白间相互作用的深入研究,可以为进一步阐述菌体的运动机理,蛋白分泌机制,能量代谢途径,为预防和治疗铜绿假单胞菌引起的感染提供理论依据。