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背景:铜绿假单胞菌是临床常见的病原菌。根据2020年中国细菌耐药监测网(China Antimic-robial Surveillance Network，CHINET)数据，在中国三级医院获得的所有临床样本分离的细菌中，排在前4位的是大肠杆菌、克雷伯菌、不动杆菌属和铜绿假单胞菌，其中，铜绿假单胞菌作为一种条件致病菌，在营养匮乏的环境中依然可以生存繁殖，并导致临床免疫功能低下患者(如肺囊性纤维化患者，肿瘤患者)产生细菌感染，成为院内感染的常见病原菌。近年来，由于抗菌药物的长期使用甚至滥用，导致耐药菌株越来越多，作为临床治疗多重耐药菌感染的碳青霉烯类抗菌药物也不例外。2020年中国细菌耐药监测网数据显示，铜绿假单胞菌对美罗培南的耐药率为19.3％，对亚胺培南的耐药率为23.2％。铜绿假单胞菌耐药机制错综复杂，如膜渗透性改变、外排增加、生物膜的形成、产酶增加等，使得感染难以控制，有效的抗菌治疗成为医师及药师亟待解决的问题。在众多的耐药机制中，细菌产生生物膜可阻碍抗菌药物进入菌体内，使胞内有效药物浓度减低，抗菌活性下降，进而导致耐药菌株的产生，因此，抗生物膜形成成为有效抗菌药物治疗的切入点之一。
磷霉素(Fosfomycin，FOS)和利福平(Rifampin，RIF)都是在临床应用已久的抗菌药物，价格低廉，安全性高。已有研究表明，利福平和磷霉素联用对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜(methicillin-resistant Staphy，lococcus aureus，MRSA)有较高活性。通过检索文献，我们得知目前虽然有针对利福平和磷霉素抗金黄色葡萄球菌植入性相关感染的研究，但是并没有两者联用抗铜绿假单胞菌的相关研究。
目的:探索利福平联合磷霉素抗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(carbapenem-resisrant Pseudomonasaeruginosa，CRPA)的作用，并初步探索两者协同的作用机制。
方法:实验所使用的菌株均为山东第一医科大学第一附属医院临床分离所得。采用CLSIM100-S28推荐的测定细菌敏感性的方法:微量肉汤稀释法。筛选出10株对碳青霉烯类耐药的菌株，同时筛选出10株敏感菌株作为对照菌株。首先进行的是利福平和磷霉素联用体外抗菌效果的评估，采用标椎肉汤稀释法测定两种药物联用对铜绿假单胞菌的作用，用分级抑菌浓度指数(Fractional inhibitory concentration index，FICI)模型来评价利福平和磷霉素联用是否有协同作用。然后通过绘制时间杀菌曲线，评价联合用药抗铜绿假单胞菌的动态作用。采用结晶紫染色法测定利福平与磷霉素联用对生物膜形成的抑制作用，然后用同样方法测定两药联合对预先形成生物膜的消除作用。最后测定两药联合对铜绿假单胞菌群集运动的影响。初步探索利福平与磷霉素联用抗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的作用机制。
结果:
1.常用抗菌药物敏感性测定与耐药背景分析
根据CLSI标准，以微量肉汤稀释法测定常用抗菌药物的最低抑菌浓度(Minimal inhibit-ory concentration，MIC)。根据测定结果，定义耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(carbapenem-resist-ant Pseudomonas aeruginosa，CRPA)为对美罗培南或者亚胺培南耐药的菌株，以PA11-PA20命名。敏感菌株作为对照菌株，以PA1-PA10命名。最低抑菌浓度测定结果显示:所有铜绿假单胞菌菌株对多粘菌素B和阿米卡星耐药率较低，分别为20％和10％。筛选的10株碳青霉烯类铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率为100％，对美罗培南的耐药率为80％，对左氧氟沙星的耐药率为90％，对头孢他啶、哌拉西林他唑巴坦、氨曲南耐药率为100％。PA1-PA10菌株对测定的抗菌药物均敏感(利福平和磷霉素除外)。
2.利福平和磷霉素联合使用具有协同抗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的作用
根据CLSI标准，以微量肉汤稀释法测定利福平与磷霉素联用对抗铜绿假单胞菌的作用。结果显示，当利福平与磷霉素联合使用时，对所有菌株(耐碳青霉烯类菌株和敏感菌株)均有协同抗菌作用(FICI≦0.5)，协同率为100％。以PA11(CRPA)为例，两者联用能使FOS的最低抑菌浓度从512μg/mL降低到8μg/mL，使RIF的MIC从32μg/mL降低至4μg/mL。两种药物联合对抗铜绿假单胞菌有显著协同作用。随后时间杀菌曲线证实了两药联合对铜绿假单胞菌的动态抗菌作用。
3.利福平与磷霉素联合使用对抗铜绿假单胞菌预先形成生物膜有协同作用
采用FICI模型评价两药联用对铜绿假单胞菌预形成24小时生物膜的抑制作用。利福平和磷霉素联合对抗铜绿假单胞菌预先形成生物膜有协同作用，协同率为75％。可以使磷霉素的MBIC80由≥1024μg/mL降至64μg/mL，使利福平的MBIC80由32μg/mL-128μg/mL降至8μg/mL-16μg/mL。
4.利福平和磷霉素联用可明显抑制耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌生物膜的形成
实验测定利福平与磷霉素联用抗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌生物膜作用。实验在96孔组织培养板上进行，使用结晶紫染色法测定生物膜的成膜量。用酶标仪测定595nm波长处的生物膜的吸光度值。采用计算抑制生物膜生成量的百分率的方法来评价两者联用对生物膜的抑制作用。结果显示，利福平和磷霉素对生物膜均有抑制作用，尤其是利福平，在浓度为1/16MIC(2μg/mL)时，可抑制67％PA生物膜的形成，与磷霉素(32μg/mL)联用时，可抑制生物膜形成的90％，与利福平单独使用时比较，两药联用时对生物膜的抑制增加了23％，两者相比有统计学意义(p＜0.001)。当利福平与磷霉素的浓度为1/32MIC(利福平浓度为1μg/mL、磷霉素浓度为16μg/mL)时，联合使用比利福平单独使用时对生物膜的抑制增加了36％，两者相比有统计学意义(p＜0.0001)。
5.利福平和磷霉素联用可消除预先形成的铜绿假单胞菌生物膜
实验测定利福平与磷霉素联用消除预先形成的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌生物膜的作用。采用结晶紫染色法测定生物膜的成膜量。实验步骤与抑制生物膜生成实验相同，区别在于此次实验预先在96孔组织培养板上加入100μL稀释好的菌液，于37℃培养24h条件下，使其形成生物膜，然后再加入抗菌药物进行培养。最后的结果以消除生物膜生成量的百分率来表示。当利福平浓度为1/4MIC(8μg/mL)时，生物膜减少了31％，与磷霉素(128μg/mL)联用时使生物膜量减少了64％，两者相比有统计学差异(p＜0.01)。当利福平浓度为1/8MIC(4μg/mL)时(生物膜减少11％)，与同磷霉素(64μg/mL)联用时比较(生物膜减少58％)，使生物膜的消除量增加了46％，两者相比有统计学差异(p＜0.01)。
6.利福平和磷霉素联用对CRPA群集运动有明显的抑制作用
群集运动是细菌在利用鞭毛在半固体表面移动的能力。本实验通过配置半固体琼脂培养基，测定使用药物干预对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌群集运动的作用。实验数据通过培养24小时后测量菌落直径获得。磷霉素(浓度为32μg/mL)单独使用时，测量的菌落直径为5mm，与对照组相比(5.4mm)，差异无统计学意义。利福平(浓度为2μg/mL)单独使用时对群集运动也有抑制作用(菌落直径为4.5mm)，与磷霉素(浓度为32μg/mL)联用时，测量的菌落直径为3.2mm，对CRPA群集运动的抑制作用明显增强(p＜0.01)。
结论:本文首次探索了利福平与磷霉素联用对铜绿假单胞菌的作用。研究表明，利福平与磷霉素联用不仅对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌有协同作用，对敏感菌株也有协同作用，协同率均为100％。通过绘制时间杀菌曲线验证了两药联用的动态抗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的作用。药物联用潜在的协同机制可能与以下两个方面有关，抑制生物膜的形成，抑制群集运动。未来我们还将就协同抗铜绿假单胞菌机制问题进行更为深入的探讨。本研究为寻找新的抗铜绿假单胞菌治疗策略提供了思路。
磷霉素(Fosfomycin，FOS)和利福平(Rifampin，RIF)都是在临床应用已久的抗菌药物，价格低廉，安全性高。已有研究表明，利福平和磷霉素联用对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜(methicillin-resistant Staphy，lococcus aureus，MRSA)有较高活性。通过检索文献，我们得知目前虽然有针对利福平和磷霉素抗金黄色葡萄球菌植入性相关感染的研究，但是并没有两者联用抗铜绿假单胞菌的相关研究。
目的:探索利福平联合磷霉素抗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(carbapenem-resisrant Pseudomonasaeruginosa，CRPA)的作用，并初步探索两者协同的作用机制。
方法:实验所使用的菌株均为山东第一医科大学第一附属医院临床分离所得。采用CLSIM100-S28推荐的测定细菌敏感性的方法:微量肉汤稀释法。筛选出10株对碳青霉烯类耐药的菌株，同时筛选出10株敏感菌株作为对照菌株。首先进行的是利福平和磷霉素联用体外抗菌效果的评估，采用标椎肉汤稀释法测定两种药物联用对铜绿假单胞菌的作用，用分级抑菌浓度指数(Fractional inhibitory concentration index，FICI)模型来评价利福平和磷霉素联用是否有协同作用。然后通过绘制时间杀菌曲线，评价联合用药抗铜绿假单胞菌的动态作用。采用结晶紫染色法测定利福平与磷霉素联用对生物膜形成的抑制作用，然后用同样方法测定两药联合对预先形成生物膜的消除作用。最后测定两药联合对铜绿假单胞菌群集运动的影响。初步探索利福平与磷霉素联用抗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的作用机制。
结果:
1.常用抗菌药物敏感性测定与耐药背景分析
根据CLSI标准，以微量肉汤稀释法测定常用抗菌药物的最低抑菌浓度(Minimal inhibit-ory concentration，MIC)。根据测定结果，定义耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(carbapenem-resist-ant Pseudomonas aeruginosa，CRPA)为对美罗培南或者亚胺培南耐药的菌株，以PA11-PA20命名。敏感菌株作为对照菌株，以PA1-PA10命名。最低抑菌浓度测定结果显示:所有铜绿假单胞菌菌株对多粘菌素B和阿米卡星耐药率较低，分别为20％和10％。筛选的10株碳青霉烯类铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率为100％，对美罗培南的耐药率为80％，对左氧氟沙星的耐药率为90％，对头孢他啶、哌拉西林他唑巴坦、氨曲南耐药率为100％。PA1-PA10菌株对测定的抗菌药物均敏感(利福平和磷霉素除外)。
2.利福平和磷霉素联合使用具有协同抗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的作用
根据CLSI标准，以微量肉汤稀释法测定利福平与磷霉素联用对抗铜绿假单胞菌的作用。结果显示，当利福平与磷霉素联合使用时，对所有菌株(耐碳青霉烯类菌株和敏感菌株)均有协同抗菌作用(FICI≦0.5)，协同率为100％。以PA11(CRPA)为例，两者联用能使FOS的最低抑菌浓度从512μg/mL降低到8μg/mL，使RIF的MIC从32μg/mL降低至4μg/mL。两种药物联合对抗铜绿假单胞菌有显著协同作用。随后时间杀菌曲线证实了两药联合对铜绿假单胞菌的动态抗菌作用。
3.利福平与磷霉素联合使用对抗铜绿假单胞菌预先形成生物膜有协同作用
采用FICI模型评价两药联用对铜绿假单胞菌预形成24小时生物膜的抑制作用。利福平和磷霉素联合对抗铜绿假单胞菌预先形成生物膜有协同作用，协同率为75％。可以使磷霉素的MBIC80由≥1024μg/mL降至64μg/mL，使利福平的MBIC80由32μg/mL-128μg/mL降至8μg/mL-16μg/mL。
4.利福平和磷霉素联用可明显抑制耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌生物膜的形成
实验测定利福平与磷霉素联用抗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌生物膜作用。实验在96孔组织培养板上进行，使用结晶紫染色法测定生物膜的成膜量。用酶标仪测定595nm波长处的生物膜的吸光度值。采用计算抑制生物膜生成量的百分率的方法来评价两者联用对生物膜的抑制作用。结果显示，利福平和磷霉素对生物膜均有抑制作用，尤其是利福平，在浓度为1/16MIC(2μg/mL)时，可抑制67％PA生物膜的形成，与磷霉素(32μg/mL)联用时，可抑制生物膜形成的90％，与利福平单独使用时比较，两药联用时对生物膜的抑制增加了23％，两者相比有统计学意义(p＜0.001)。当利福平与磷霉素的浓度为1/32MIC(利福平浓度为1μg/mL、磷霉素浓度为16μg/mL)时，联合使用比利福平单独使用时对生物膜的抑制增加了36％，两者相比有统计学意义(p＜0.0001)。
5.利福平和磷霉素联用可消除预先形成的铜绿假单胞菌生物膜
实验测定利福平与磷霉素联用消除预先形成的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌生物膜的作用。采用结晶紫染色法测定生物膜的成膜量。实验步骤与抑制生物膜生成实验相同，区别在于此次实验预先在96孔组织培养板上加入100μL稀释好的菌液，于37℃培养24h条件下，使其形成生物膜，然后再加入抗菌药物进行培养。最后的结果以消除生物膜生成量的百分率来表示。当利福平浓度为1/4MIC(8μg/mL)时，生物膜减少了31％，与磷霉素(128μg/mL)联用时使生物膜量减少了64％，两者相比有统计学差异(p＜0.01)。当利福平浓度为1/8MIC(4μg/mL)时(生物膜减少11％)，与同磷霉素(64μg/mL)联用时比较(生物膜减少58％)，使生物膜的消除量增加了46％，两者相比有统计学差异(p＜0.01)。
6.利福平和磷霉素联用对CRPA群集运动有明显的抑制作用
群集运动是细菌在利用鞭毛在半固体表面移动的能力。本实验通过配置半固体琼脂培养基，测定使用药物干预对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌群集运动的作用。实验数据通过培养24小时后测量菌落直径获得。磷霉素(浓度为32μg/mL)单独使用时，测量的菌落直径为5mm，与对照组相比(5.4mm)，差异无统计学意义。利福平(浓度为2μg/mL)单独使用时对群集运动也有抑制作用(菌落直径为4.5mm)，与磷霉素(浓度为32μg/mL)联用时，测量的菌落直径为3.2mm，对CRPA群集运动的抑制作用明显增强(p＜0.01)。
结论:本文首次探索了利福平与磷霉素联用对铜绿假单胞菌的作用。研究表明，利福平与磷霉素联用不仅对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌有协同作用，对敏感菌株也有协同作用，协同率均为100％。通过绘制时间杀菌曲线验证了两药联用的动态抗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的作用。药物联用潜在的协同机制可能与以下两个方面有关，抑制生物膜的形成，抑制群集运动。未来我们还将就协同抗铜绿假单胞菌机制问题进行更为深入的探讨。本研究为寻找新的抗铜绿假单胞菌治疗策略提供了思路。