目前我国大肠癌的发病率与病死率仍位于所有恶性肿瘤的前列,且有逐年上升的趋势。大肠癌患者综合治疗的5年生存率徘徊在30%左右。目前影响大肠癌长期生存的主要原因是复发和转移,因此进一步研究大肠癌的发生和发展,对于寻找新的治疗手段并提高临床治疗效果具有重要意义。RB基因是最早被克隆的抑癌基因,其蛋白表达产物就是视母细胞肿瘤抑制蛋白(Rb)。Rb在细胞周期调控中发挥非常重要的作用,对保证细胞周期的稳定有重要意义。Cdk4是细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdks)家族成员,且是G1期的重要因子,在一些肿瘤细胞株中已经发现有Cdk4基因的扩增、突变或高表达。Cdk4与Rb磷酸化以及出核有关,它介导的磷酸化使得Rb发生失活。在G1期,Rb处于低磷酸化状态,并且主要集中在细胞核内。而在S期,Rb则处于高磷酸化状态,即失活状态。研究证实,在成纤维细胞的细胞周期各个阶段,Rb都限制性分布在细胞核内。而将癌基因导入成纤维细胞内后,Rb核质比例则发生明显的变化。本课题通过研究Cdk4和Rb磷酸化在大肠癌发生发展过程中的作用和机制,在组织和细胞两个水平,了解Rb及其磷酸化蛋白(pho-Rb)在正常粘膜、大肠息肉、大肠癌局部病灶中表达程度的差异,同时研究Cdk4导致Rb过磷酸化以及Rb自身细胞分布的改变对大肠癌肿瘤细胞周期和肿瘤侵袭性的作用,以进一步探讨大肠癌的发生和发展的机制,为今后可能的靶向治疗提供理论依据。目的观察Rb和Cdk4在大肠癌由正常粘膜—腺瘤性息肉—恶变过程中的表达水平有无差别,了解两者在大肠癌发生过程中的可能作用。方法采集复旦大学附属中山医院2009年5月至8月普外科及内镜中心手术切除的大肠癌和腺瘤性息肉标本,以及正常粘膜组织,抽提组织蛋白及mRNA,通过WesternBlot、反转录和实时定量PCR方法检测并观察组织中Rb,pho-Rb,Cdk4蛋白以及Cdk4 mRNA的表达差异。1.Rb在大肠癌组织中的表达明显高于腺瘤组织以及正常组织,并且以高磷酸化状态为主,腺瘤组织及正常组织中两者的表达无明显差异。2.Cdk4蛋白及mRNA的表达在正常组织、腺瘤组织以及大肠癌组织中依次升高,差异具有统计学意义。1.Rb在腺瘤晚期或癌变早期过程中表达升高,并在磷酸化作用下发生失活,可能参与大肠癌的发生过程。2.Cdk4在大肠癌变过程中可能起一定作用,从腺瘤到癌变这一变化过程可能与Rb的过磷酸化有关,而在正常粘膜到腺瘤过程中,可能是通过其他途径起作用。目的细胞水平限制Rb出核或过磷酸化Rb,观察大肠癌细胞侵袭性的改变,了解Rb细胞内分布及磷酸化对肿瘤发展的作用方法使用出核蛋白抑制物Leptomycin B (LMB)处理大肠癌细胞Lovo株,使Rb限制性分布在细胞核内,通过肿瘤侵袭实验(Transwell法)观察肿瘤细胞侵袭性的变化。从Lovo细胞中得到Cdk4全长基因,以pcDNA3-flag为载体,构建Cdk4R24C突变质粒,转染Lovo细胞,Transwell法观察肿瘤细胞侵袭性的变化。1.30nM LMB限制Rb在细胞核内的效果满意。2.将Rb限制在Lovo肿瘤细胞细胞核内,对于肿瘤细胞的细胞周期无明显影响,肿瘤细胞侵袭性无显著变化。3.过磷酸化Rb可以改变Lovo肿瘤细胞的细胞周期,并且使得肿瘤细胞的侵袭性显著增强。1.Rb在大肠癌肿瘤细胞Lovo株内分布与细胞周期无明显相关性,改变肿瘤细胞内的Rb分布对肿瘤侵袭性无明显作用。2.过磷酸化Rb可以改变Lovo肿瘤细胞内的周期,使细胞由G1期向S期转变,并且过磷酸化Rb与Lovo肿瘤细胞侵袭能力呈正相关。