论文部分内容阅读
目的:流体剪切应力(FSS)可以抑制成骨细胞的凋亡。但是,ERK5在流体剪切应力介导的抗成骨细胞凋亡效应中的作用还不清楚,ERK5在体内对骨代谢平衡的影响也未见报道。因此,对ERK5信号通路在成骨细胞凋亡和骨质疏松中的作用进行研究,能够为临床治疗骨质疏松提供新的治疗靶标。方法:将FSS作为激活ERK5的机械刺激,XMD8-92(ERK5特异性抑制剂)或ERK5-siRNA为抑制ERK5活性的干预措施,分别通过FSS、TNF-α、XMD8-92、ERK5-siRNA单独或多种干预后的MC3T3-E1细胞进行Hoechest33258染色、TUNEL特异性凋亡染色、流式细胞技术来检测凋亡比率、使用PCR array检测ERK5下游凋亡相关的因子变化、使用酶标仪检测caspase-3的活性,以及使用Western blotting来检测各种蛋白的表达变化;对小鼠腹腔注射XMD8-92和/或地塞米松(DEX),观察小鼠股骨骨组织的微观结构、力学性质、增殖或凋亡相关蛋白、以及脂肪细胞数量的变化。结果:低浓度(1 ng/ml)的TNF-α对成骨细胞没有凋亡诱导作用,但是高浓度的TNF-α(10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)可以诱导成骨细胞凋亡,且呈现浓度依赖性。加载生理条件下的FSS(12dyn/cm2)1小时,可以明显促进成骨细胞内的ERK5的磷酸化,磷酸化后的ERK5会从胞浆转移至细胞核内。5μM的XMD8-92和ERK5-siRNA可以阻断或者减少成骨细胞内FSS介导的ERK5激活。FSS可以抑制TNF-α诱导的成骨细胞凋亡,细胞凋亡率从34.2%减少到13.8%。XMD8-92或者ERK5-siRNA能够加剧成骨细胞的凋亡,并且能够逆转FSS的抗成骨细胞凋亡的效应。进一步的分析发现,XMD8-92能够抑制成骨细胞内Bad的磷酸化,且FSS介导的Bad的磷酸化也能够被XMD8-92所阻断。与TNF-α处理组相比,在ERK5-siRNA+TNF-α成骨细胞内akt基因表达被抑制,而fasl、bim、caspase-3的基因表达却被激活。进一步的实验结果表明ERK5-siRNA的转染能够阻断FSS诱导的成骨细胞内ERK5,AKT,Fox O3a的激活。AKT抑制剂LY294002能够抑制AKT-FoxO3a信号通路的激活,但不能抑制ERK5的激活。ERK5基因沉默增加了TNF-α诱导的成骨细胞内FasL和Bim的表达,以及caspase-3的活性;但是,FSS介导的ERK5激活却能够下调TNF-α诱导的成骨细胞内Fas L和Bim的表达,以及降低caspase-3的活性。体内实验表明,腹腔注射XMD8-92可以抑制小鼠骨组织内ERK5的磷酸化;形态学和生物力学检测研究表明XMD8-92可以使小鼠骨量减少,并加剧地塞米松诱导的骨质疏松;我们还发现XMD8-92上调了小鼠骨组织内和成骨细胞内的RANKL/OPG的比率和FasL的表达,但是抑制了Cyclin B1和CDK1的表达,从而导致成骨细胞的凋亡增多而增殖减少,引起了骨质疏松的发生;另外,XMD8-92也可以增加小鼠骨组织内脂肪细胞的数量。有趣的是,XMD8-92也同样加剧了DEX诱导的上述指标的变化。结论:1.FSS通过ERK5信号通路抑制成骨细胞凋亡的机制:FSS产生生物学信号并传递至成骨细胞内而激活ERK5,磷酸化的ERK5发生构象改变,并转位至细胞核内;a,磷酸化的ERK5能够促使Bad发生磷酸化,激活后的Bad与14-3-3蛋白结合而被隔离在细胞浆中,并不能被转移至线粒体内,从而抑制了Caspas-3的活性。b,活化后的ERK5激活AKT,磷酸化的AKT进一步促进FoxO3a的磷酸化,磷酸化后的FoxO3a与14-3-3蛋白结合而被隔离在细胞浆中,从而导致其下游的前凋亡相关蛋白FasL和Bim的表达减少,最终导致Caspase-3的活性的降低,最终抑制了成骨细胞的凋亡。2.ERK5参与骨质疏松的具体机制有4条:ERK5的失活会导致a,小鼠骨组织内RANKL/OPG蛋白表达的比例上调;b,抑制Cyclin B1/CDK1蛋白的表达,从而使得成骨细胞增殖减弱;c,上调FasL蛋白表达后增加成骨细胞的凋亡;d,增加了脂肪细胞的数量。上述的改变最终导致了骨量减少和地塞米松诱导的骨质疏松的加重。