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背景:
食管癌是我国最常见的恶性消化道肿瘤之一。它的校正死亡率达20.4/10万,居世界第六位。鳞状细胞癌是食管癌的主要病理类型,占全部食管癌的95%左右。虽然近年来其诊断和综合治疗状况有很大进展,但5年生存率仍在15%-24%左右,并未得到根本性的改善。导致食管癌治疗失败的主要原因是肿瘤的复发和耐药。
孕烷X受体(PXR)是配体活化的转录因子,是核受体家族重要成员之一。其主要生物学功能是参与机体对内源及外源化合物的代谢、排泄过程,是核受体家族重要成员之一。PXR可以抑制炎症,在促进或抑制某些肿瘤细胞增殖中起重要作用,参与肿瘤多药耐药形成的机制,大量研究表明PXR参与调控肿瘤细胞的凋亡也可能是其诱导耐药的机制之一。
目的:
本研究通过检测孕烷X受体在食管癌EC9706细胞中的表达,拟使用利福平活化食管鳞癌EC9706细胞中的PXR受体,阿霉素诱导高表达PXR受体的EC9706细胞凋亡,比较高表达PXR受体的EC9706细胞与正常表达PXR受体的EC9706细胞凋亡率以及抗凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-xL的表达差异,探索孕烷X受体抗食管鳞癌细胞凋亡中的作用。
方法:
1.采用利福平活化食管鳞癌EC9706细胞中的PXR受体,建立表达PXR的食管鳞癌可传代细胞系。
2.应用流式细胞仪、四氮唑蓝比色法(MTT法)、RT-PCR等方法测定表达PXR的食管鳞癌可传代细胞系的建立是否成功。
3.用阿霉素诱导野生型PXR食管鳞癌细胞系和表达PXR的食管鳞癌可传代细胞系凋亡。
4.应用MTT法、Western-Blot、免疫组化法研究阿霉素对两种类型的人EC9706增殖情况的影响,探索孕烷X受体抗EC9706凋亡中的作用。
结果:
1.MTT检测结果显示:利福平对EC9706细胞增殖具有激活作用。RIF组与对照组相比,有显著性差异(p<0.05)。
2.透射电镜结果显示:在放大4000~15000倍的透射电镜下观察,正常EC9706细胞胞膜完整,在表面有大量绒毛样突起。细胞核大、形状不规则,核仁明显变大,内染色质均匀分散,密度一致,细胞质内细胞器丰富。RIF组的EC9706细胞呈现不同程度凋亡性改变:首先会出现细胞体积逐渐缩小,细胞核的某些地方会向外突起小于90度,细胞核内的染色质会出现高度浓缩,密度会增高,汇集在核膜下,呈现出新月形小体,有的甚至还会出现核固缩和核碎裂,最后出现凋亡小体。
3.流式细胞术结果分析显示:阿霉素能使EC9706细胞生长周期受阻并发生凋亡。DMSO组和RIF组的EC9706细胞经阿霉素处理后,用流式细胞仪可测得典型的亚二倍体凋亡峰,凋亡百分率分别为4.82%、5.31%。RIF处理组与DMSO对照组相比较均差异显著(p<0.05);EC9706细胞经阿霉素处理后,细胞周期发生变化,空白对照组的细胞主要分布在S期(44.43%),其次分布在Go/Gl期(41.73%),少数分布在G2/M期(14.48%)。阿霉素处理的RIF组EC9706细胞S期减少明显,从44.43%下降至27.74%,Go/Gl期细胞数增加明显,从41.73%上升至56.75%,各处理组与对照组相比,差异具有显著性(p<0.05),根据以上结果提示细胞生长周期主要阻滞在Go/Gl期;Westernblot法半定量检测EC9706细胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达结果显示:与阿霉素处理的DMSO组相比,阿霉素处理的RIF组的Caspase-3蛋白的光密度OD值显著降低(p<0.05),而Bcl-2蛋白的光密度OD值显著升高(p<0.05),而RIF处理组与DMSO组对照组的Bax蛋白无显著性差异(P>0.05)。
4.免疫组化检测结果显示:Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白主要表达于细胞浆,可见棕褐色着色。与阿霉素处理的DMSO组相比,阿霉素处理的RIF组Caspase-3蛋白的细胞阳性百分率明显降低(p<0.05),Bcl-2蛋白的细胞阳性百分率则明显升高(p<0.05),Bax蛋白的细胞阳性百分率却无明显变化(P>0.05)。
结论:
1.利福平可以活化食管癌EC9706细胞中PXR的表达,增强其mRNA及核蛋白表达水平。
2.阿霉素对人食管癌细胞株EC9706的抑制作用可能与其诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞有关,PXR能使EC9706的生长周期阻滞在Go/Gl期。
3.PXR可能是通过降低Caspase-3、升高Bcl-2而发挥来对抗EC9706肿瘤作用的凋亡。