【摘 要】
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背景循环中的初始T细胞处于静息状态,代谢需求较低。当初始T细胞在T细胞受体（T cell receptor,TCR）介导的抗原识别和共刺激信号,如CD28,共同作用下,T细胞被活化,其增强的合成代谢用于细胞增殖和功能发挥。m TOR（Mammalian T arget of Rapamycin,m TOR）为CD28下游信号节点,其被激活能促进合成代谢基因表达,满足细胞增殖中间产物合成需求。而AM
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背景循环中的初始T细胞处于静息状态,代谢需求较低。当初始T细胞在T细胞受体（T cell receptor,TCR）介导的抗原识别和共刺激信号,如CD28,共同作用下,T细胞被活化,其增强的合成代谢用于细胞增殖和功能发挥。m TOR（Mammalian T arget of Rapamycin,m TOR）为CD28下游信号节点,其被激活能促进合成代谢基因表达,满足细胞增殖中间产物合成需求。而AMPK（Amp-activated protein kinase,AMPK）被认为是m TOR信号抑制因子,其被激活则促进分解代谢基因表达,满足细胞ATP能量生成需求。AMPK-m TOR信号通路在介导T细胞活化代谢中起着至关重要的作用。SIRT4是sirtuins家族的成员之一,已报道在多种代谢性疾病的发生发展中发挥重要的调节作用如,糖尿病。但SIRT4在T细胞活化代谢中的作用机制有待进一步阐明。目的研究SIRT4对AMPK-m TOR信号介导的T细胞活化及代谢影响,探讨可能的分子机制。方法1.构建SIRT4基因敲除小鼠,通过对小鼠脾脏中SIRT4表达水平、外周血葡萄糖和胰岛素水平、葡萄糖耐量实验和胰脏组织GDH（Glutamate dehydrogenase,GDH）活性测定,评估SIRT4基因敲除效果。2.以SIRT4敲除小鼠为研究对象,采用MTS方法测定CD4+T细胞在CD3/CD28和IL-2条件下,体外刺激培养增殖情况;采用ELISA方法测定CD4+T细胞在CD3/CD28条件下,细胞因子IL-2分泌情况;采用seahorse细胞代谢检测技术,测定在CD3/CD28和IL-2刺激条件下,细胞线粒体代谢情况;采用Western blotting方法,检测SIRT1表达水平、m TOR和AMPKa的磷酸化情况。3.采用seahorse细胞代谢检测技术,测定过表达SIRT4的Jurkat细胞在CD3/CD28刺激条件下,细胞线粒体代谢情况;采用Western blotting方法,检测m TOR和AMPKa的磷酸化情况。4.构建SIRT1敲除Jurkat细胞,在PMA和Ionomycin刺激条件下,采用Western blotting方法,检测SIRT4表达水平,m TOR和AMPKa的磷酸化情况;利用荧光共聚焦显微成像技术,进行SIRT1敲除Jurkat细胞SIRT4的线粒体定位检测。结果1.SIRT4敲除小鼠脾脏中SIRT4蛋白的表达明显低于对照组（P＜0.05）,SIRT4敲除小鼠体内血糖水平明显低于对照组（P＜0.05）,胰岛素和GDH活性明显高于对照组（P＜0.05）。2.SIRT4敲除的CD4+T细胞增殖能力显著低于WT组（P＜0.05）,IL-2分泌水平明显低于WT组（P＜0.05）;并且细胞耗氧量明显降低,线粒体氧化磷酸化降低（P＜0.05）;磷酸化AMPKa表达明显降低,SIRT1和磷酸化m TOR表达明显增加（P＜0.05）。3.与对照组比较,过表达SIRT4的Jurkat细胞磷酸化m TOR表达明显降低（P＜0.05）,磷酸化AMPKa表达明显增加（P＜0.05）且细胞活化后,耗氧量明显增高,线粒体氧化磷酸化增强（P＜0.05）。4.SIRT1敲除后,SIRT4和磷酸化AMPKa表达明显增高（P＜0.05）,磷酸化m TOR表达明显降低（P＜0.05）;与弥散状野生型比较,SIRT4定位在SIRT1敲除细胞的线粒体呈现点状聚集。结论1.在T细胞的活化代谢过程中,SIRT4能通过激活AMPK信号来促进T细胞代谢及增殖。2.SIRT4与SIRT1对T细胞AMPK信号的调控存在相互拮抗作用。
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