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我国青杨派树种资源丰富,普遍具有速生、易繁殖、耐干旱、抗寒冷等特点,但遗传改良程度相对较低。引入多倍体育种技术对青杨派树种进行遗传改良,为我国“三北”地区提供生长迅速、材性优良、适应性强的林木良种,对当地生态环境的改善和经济水平的发展具有重要意义。本研究以‘哲引3号杨’(Populus pseudo—simonii× p. nigra‘Zheyin3#’)、小青杨(p. pseudo—simonii)、小叶杨(p. simonii)、‘通辽杨’(p. simonii×p. nigra‘Tongliao’)等青杨派树种及杂种雌、雄无性系为材料,围绕青杨派树种天然2n花粉发生及其细胞学机制、雌雄配子与合子染色体加倍,以及多倍体检测等多倍体育种技术进行了研究,取得了一定的进展。
1.首次发现我国青杨派树种存在天然2n花粉,其中5个小青杨无性系天然2n花粉发生频率介于0.33—1.55%,9个小叶杨无性系天然2n花粉发生频率为0.48—3.10%,而‘通辽杨’无性系则可产生2.29%的2n花粉。进一步利用醋酸洋红压片和微管骨架免疫荧光分析揭示,小孢子母细胞减数分裂末期Ⅱ细胞成膜体缺失导致胞质分裂异常是2n花粉发生的主要细胞学机制。
2.明确了施加理化处理诱导小青杨、‘通辽杨’等青杨派树种及杂种无性系花粉染色体加倍的最佳始处理时期和处理强度。其中,施加秋水仙碱进行处理,以小孢子母细胞减数分裂细线末期—粗线期为最佳始处理时期,0.5%秋水仙碱溶液连续注射处理5次,每次间隔4h,可取得较好效果,小青杨2n花粉比率最高可达60.69%,通辽杨’2n花粉比率也达到30%;施加高温处理以减数分裂终变期一中期Ⅰ为最佳始处理时期,处理强度不宜过大,以38℃高温持续处理2—4 h较为合适,小青杨2n花粉比率可达59%以上,而‘通辽杨’2n花粉比率最高可达50.28%。
3.提出以雌花芽发育形态为参照即时判别‘哲引3号杨’大孢子发生进程的方法,明确了施加理化处理诱导大孢子染色体加倍的最佳始处理时期,首次通过大孢子染色体加倍途径获得青杨派杂种三倍体159株。其中,施加秋水仙碱溶液处理诱导大孢子染色体加倍共获得13株三倍体,当雌花芽芽鳞微张、花序未露出,即大孢子母细胞减数分裂处于粗线期至双线期时,施加0.3%-0.5%的秋水仙碱溶液浸泡处理24 h效果较好;施加高温处理雌花芽诱导大孢子染色体加倍共获得三倍体146株,当雌花芽芽鳞张开、花序微露,即大孢子母细胞减数分裂处于双线期一中期Ⅰ时,施加41—44℃高温连续处理3—5 h的诱导效果较好。
4.以‘哲引3号杨’雌蕊柱头最佳授粉时期作为起始参照点估测胚囊发育进程,明确了施加理化处理诱导胚囊染色体加倍的最佳始处理时期,首次通过胚囊染色体加倍途径获得青杨派杂种三倍体68株。其中,当‘哲引3号杨’雌花序长约5.62cm,花序上所有苞片均外翻甚至脱落,柱头露出,所有柱头经过氧化物酶试纸溶液测试均呈蓝色阳性反应时,‘哲引3号杨’雌花序达到最佳授粉时期;施加秋水仙碱处理诱导胚囊染色体加倍共获得三倍体23株,以授粉后54—66 h实施处理效果最好;施加高温处理诱导胚囊染色体加倍获得三倍体45株,以授粉后66—72 h施加41℃高温持续处理4—6 h或44℃高温处理2h的效果较好;细胞学分析表明,四核胚囊期是理化处理诱导‘哲引3号杨’胚囊染色体加倍选育三倍体的最佳始处理时期,即通过抑制胚囊发育过程第三次有丝分裂实现2n雌配子的诱导,但也并不能完全排除第一次和第二次有丝分裂过程受抑制而形成2n雌配子的可能性。
5.首次提出以子房内絮状纤维发育状态即时判别合子发育进程的方法,在此基础上施加理化处理诱导‘哲引3号杨’ב北京杨’(p.×beijingensis)合子染色体加倍,获得青杨派杂种同源四倍体8株。细胞学分析表明,授粉后7—8 d,子房内絮状纤维包裹胚珠基部和中部,但尚未完全覆盖胚珠时,多数合子进入第一次有丝分裂;在授粉后7d,以0.5%秋水仙碱溶液处理‘哲引3号杨’ב北京杨’果序24 h,诱导获得四倍体3株;在授粉后7—8 d,施加38—44℃高温持续处理‘哲引3号杨’ב北京杨’果序4h,获得四倍体5株。
6.通过对大量青杨派杂种多倍体植株气孔密度、气孔大小以及幼叶间期细胞核染色中心数目的统计分析,提出气孔密度结合气孔大小鉴定法、幼叶细胞间期核染色中心计数鉴定法等青杨派多倍体快速检测方法,完善了杨树多倍体检测技术体系。其一,可综合利用气孔密度和气孔大小两个参数初步判别青杨派杂种三倍体,即将由上往下完全展开的第15叶叶背表皮在40×物镜下气孔数低于40,且气孔面积大于603.10μ㎡的植株判定为三倍体植株;其二,可利用植株幼叶细胞间期核染色中心数目初步判别青杨派杂种多倍体,在实际应用中,可将染色中心数目最大值大于40且小于60的植株初步判定为三倍体,而将染色中心数目最大值大于60则判定为四倍体。
7.对部分多倍体植株2年生实生苗地径和株高测量分析表明,无论是大孢子染色体加倍还是胚囊染色体加倍,获得的‘哲引3号杨’ב北京杨’杂种三倍体与相同杂交组合二倍体平均值相比均具有一定的生长优势,其中生长最佳的三倍体植株地径和株高分别超过二倍体平均值152%和59%;而四倍体植株则与相同杂交组合二倍体植株在生长方面则表现相当。同时,‘哲引3号杨’ב北京杨’杂种三倍体体也并非株株皆优,仍需要对其进行无性系测定,选择生长表现优良的无性系。