动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是一种慢性炎症性反应。巨噬细胞在体内参与天然免疫反应以及特异性免疫反应,在AS中具有重要的推动作用。巨噬细胞的极化是由巨噬细胞根据微环境的不同做出的自身表型的转变,其中M1型极化具有推动炎症反应发生的作用。JAK1-STAT1-SOCS1通路是导致M1型极化的重要信号通路,mi R-155被认为与炎症反应密切相关,同时其下游靶点之一为SOCS1.本课题组长期致力于研究丹皮酚抗AS,并取得一定的成果。本实验主要探究丹皮酚对巨噬细胞M1型极化的作用及机制。目的探究丹皮酚对巨噬细胞M1型极化的影响,进一步探讨该作用是否通过对mi R-155的调控并影响下游JAK1-STAT1通路而产生的,为丹皮酚抗动脉粥样硬化机制研究提供新思路。方法采用脂多糖（li-popolysaceharides,LPS）和干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）共刺激RAW264.7细胞24 h建立巨噬细胞M1型极化的模型,丹皮酚在刺激前24h对细胞起到预保护措施。CCK-8法检测LPS和IFN-γ共刺激对细胞的损伤作用,流式细胞术检测M1型表面标志物F4/80和CD86的表达,ELISA法检测细胞上清液中炎症因子白介素-6（interleukin 6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-αTNF-α）的分泌,通过试剂盒转染抑制及过表达mi RNA-155,RT-q PCR法检测各组细胞mi R-155的表达,Western blot法检测JAK1-STAT1-SOCS1通路上的蛋白表达。结果1.IFN-γ与LPS共刺激建立巨噬细胞M1型极化模型1.1 IFN-γ与LPS对巨噬细胞存活率的影响在IFN-γ浓度^[1-3]为20 ng·m L^-1,LPS浓度范围为50-250 ng·m L^-1时,RAW264.7细胞的生存率不低于80%,与空白组相比无明显降低（P>0.05）,说明刺激剂在该浓度范围内,对细胞没有明显损伤作用,可在此基础上进行进一步的实验研究。1.2 IFN-γ与LPS对巨噬细胞炎症反应的影响IFN-γ给药浓度为20 ng·m L^-1,LPS在100-250 ng·m L^-1范围内,巨噬细胞分泌的炎症因子IL-1β、IL-6与空白组相比明显增强（P<0.05）。1.3 IFN-γ与LPS对巨噬细胞表面标志性因子CD86和F4/80的影响IFN-γ为20 ng·m L^-1,LPS浓度为100和150 ng·m L^-1时,CD86和F4/80的荧光强度均明显升高（P<0.05）。最终选择IFN-γ浓度为20 ng·m L^-1时,LPS浓度为100 ng·m L^-1时,利用PBS为溶解剂,共同刺激24h后,巨噬细胞M1型极化模型建立成功。2.丹皮酚对巨噬细胞M1型极化的抑制作用2.1丹皮酚对巨噬细胞的炎症作用经过24h丹皮酚预保护的RAW264.7细胞M1型极化模型分泌炎症因子IL-6及TNF-α水平显著下调,表明丹皮酚可以有效抑制巨噬细胞M1型极化后造成的炎症因子的分泌。2.2丹皮酚对巨噬细胞表面M1型标志性因子CD86和F4/80表达的影响进一步用流式细胞术检测丹皮酚对巨噬细胞表面的CD86和F4/80表达的影响,丹皮酚可以显著抑制由IFN-γ与LPS共刺激造成的巨噬细胞M1型极化。3.丹皮酚抑制巨噬细胞中mi R-155的表达通过RT-PCR检测mi R-155水平,验证极化后的RAW264.7细胞mi R-155的表达情况及丹皮酚对其的作用。结果发现,与空白组相比,M1型极化后的模型组巨噬细胞高度表达mi R-155,丹皮酚预保护下的细胞与模型组相比mi R-155水平则有明显下降,说明丹皮酚可降低由IFN-γ与LPS造成的M1型巨噬细胞表面mi R-155的高表达。4.丹皮酚对JAK1-STAT1通路的抑制作用由于巨噬细胞表面具有IFN-γ受体,与受体结合后,将会激活JAK1-STAT1通路。实验利用Western blot法检测JAK1-STAT1通路上的蛋白表达。结果发现,模型组与空白组相比JAK1和STAT1的蛋白磷酸化程度明显增强,SOCS1则与之相反蛋白表达受到明显抑制;丹皮酚作用后的巨噬细胞与模型组相比JAK1和STAT1的蛋白磷酸化程度明显下降,SOCS1蛋白表达受抑制的程度减轻,说明丹皮酚对JAK1/STAT1通路具有明显抑制作用。5.丹皮酚可能通过下调mi R-155的表达抑制JAK1/STAT1通路,下调炎症反应。为了探究丹皮酚抑制巨噬细胞M1极化的作用靶点是否是mi R-155,向RAW264.7细胞转染了mi R-155-inhibitor和mi R-155-mimic,进而检测各组细胞mi R-155的表达情况及各组细胞上清液中IL-6,IL-1β和TNF-α的表达。与空白组相比,mi R-155-mimic组mi R-155表达明显升高（P<0.01）,mi R-155-inhibitor组mi R-155表达明显降低;丹皮酚组与丹皮酚+刺激剂组相比,mi R-155的表达有明显下降;当丹皮酚与刺激剂及mi R-155-inhibitor同时作用于细胞后,与丹皮酚组+刺激剂组相比无显著差异,表明丹皮酚抑制mi R-155表达的作用被阻断（P>0.05）;以上结果说明丹皮酚对mi R-155有直接调节作用。ELISA法检测了IL-6,IL-1β和TNF-α的表达,实验结果发现,mi R-155-inhibitor组的细胞上清液中,三种炎症因子的分泌与模型组相比都有明显降低,mi R-155-mimic组与模型组相比则有明显升高;丹皮酚联合mi R-155-inhibitor及刺激剂组的巨噬细胞与转染了inhibitor的巨噬细胞分泌的炎症因子无明显差异,mi R-155inhibitor抑制了mi R-155的表达,同时抑制了丹皮酚对炎症反应的作用。以上结果表明,丹皮酚对炎症反应的抑制作用很可能是通过调节mi R-155实现的。结论1.丹皮酚可以抑制由IFN-γ和LPS共刺激造成的巨噬细胞M1型极化,同时抑制巨噬细胞的炎症反应。2.丹皮酚可能通过下调巨噬细胞mi R-155的表达,促进SOCS1的表达,抑制下游JAK1-STAT1的通路传导,进而抑制巨噬细胞M1型极化,减轻巨噬细胞炎症反应的发生。