痛经是指妇女在月经前后及行经期间，下腹及腰部痉挛性疼痛，严重时伴有头痛、恶心、呕吐、肢冷等症状，多发于青春期少女、未婚及已婚未育者，是妇女常见疾病，发病率高且严重影响妇女健康和工作效率。痛经的发病原因较复杂，目前医学界普遍认为体内过高的前列腺素F_2α(prostaglandin F_2α，PGF_2α)、白三烯、催产素、血管加压素等导致子宫过度收缩，可能是其主要发病机制。其治疗药物以非甾体抗炎药和选择性环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制剂、避孕药和钙离子拮抗剂为主，这些药物能不同程度地缓解痛经症状，但具有明显的消化道、心脏或肝肾等不良反应，疗效难以持久且不宜长期服用，临床应用具有明显的局限性，因而研究开发疗效更好且不良反应小的新型痛经治疗药物十分必要。传统中药中一些经典方剂如少腹逐瘀汤、温经汤、当归芍药散等治疗痛经效果良好且副作用小，在痛经治疗中越来越受到重视。当归芍药散（Dang-gui-shao-yao-san，DSS）原载于汉代医圣张仲景的《金匮要略》，由当归、芍药、川芎、白术、茯苓、泽泻六味药组成。原方主治“妇人妊娠诸疾痛”以及“妇人杂病腹中诸疾痛”。在多年的中医临床实践中，该方用于治疗痛经有良好疗效，痛经症状明显减轻，且疗效巩固，但其发挥痛经治疗作用的活性组分或活性成分目前尚不清楚。本室前期研究发现DSS对醋酸致痛小鼠具有明显的镇痛作用，同时能明显抑制离体子宫平滑肌收缩，在此基础上，我们对DSS进行分离提取，获得了四个提取部位，即DSS-A-W-W、DSS-W、DSS-A-E和DSS-A-N-30，并采用离体子宫平滑肌收缩实验和小鼠醋酸扭体实验对它们进行了活性筛选，进而在整体痛经模型和离体子宫平滑肌模型上对筛选获得活性部位治疗痛经的作用及其可能的作用机理进行了实验研究。一、当归芍药散治疗痛经活性部位的筛选1、醋酸扭体实验筛选当归芍药散治疗痛经活性部位在小鼠醋酸扭体实验模型上观察了DSS四个提取部位的镇痛作用，结果表明，DSS-A-W-W（414.0 mg/kg）、DSS-W（1750.0 mg/kg）、DSS-A-E（230.0 mg/kg）和DSS-A-N-30（39.6 mg/kg）均可明显减少醋酸致痛小鼠的扭体次数，与阳性药阿斯匹林（100.0 mg/kg）和DSS（9000.0 mg/kg）作用一致；结果提示，DSS四个提取部位DSS-A-W-W、DSS-W、DSS-A-E和DSS-A-N-30对醋酸致痛小鼠均具有镇痛作用。2、离体子宫平滑肌实验筛选当归芍药散治疗痛经活性部位痛经与子宫的功能状态有关。本研究采用未孕动情期大鼠离体子宫平滑肌，观察了DSS四个提取部位对其自发收缩的影响，结果表明，DSS（7140.0 mg/L）单次处理能明显抑制大鼠离体子宫平滑肌自发性收缩；DSS-A-E（16.4、32.8、49.2和65.7 mg/L）和DSS-A-N-30（283.0 mg/L）单次处理即可显著抑制大鼠离体子宫平滑肌自发性收缩；DSS-W（0～643.0 mg/L）累计加药有抑制子宫平滑肌自发性收缩的趋势但无统计学意义；而DSS-A-W-W（0～2957.0 mg/L）累积加药处理对大鼠离体子宫平滑肌条的自发性收缩无明显影响。结果提示，提取部位DSS-A-E和DSS-A-N-30对大鼠离体子宫平滑肌的自发性收缩具有直接抑制作用。综合整体醋酸扭体实验和离体平滑肌实验的筛选结果，DSS-A-E和DSS-A-N-30具有镇痛作用的同时对离体子宫平滑肌的收缩亦具有抑制作用，提示它们可能是DSS治疗痛经的两个活性部位。为此，本研究在后续的实验中对它们治疗痛经的作用及其可能的机理进行了进一步研究。二、当归芍药散活性部位DSS-A-E和DSS-A-N-30的镇痛作用在前期筛选工作基础上，本研究应用醋酸扭体模型和催产素致痛经模型对DSS-A-E和DSS-A-N-30的镇痛作用进行了进一步评价。1、DSS-A-E和DSS-A-N-30对醋酸扭体小鼠的镇痛作用与模型组比较，阳性药阿斯匹林（100.0 mg/kg）和DSS（9000.0 mg/kg）能明显减少醋酸致痛小鼠的扭体次数，DSS-A-E（115.0、230.0和460.0 mg/kg）和DSS-A-N-30（19.8、39.6和79.2 mg/kg）也能明显减少模型小鼠的扭体次数，表明DSS-A-E和DSS-A-N-30对醋酸致痛模型小鼠具有明显的镇痛作用。由于醋酸扭体模型是一种以化学刺激为主要致痛原因的反映非特异性疼痛的动物模型，因此，接下来，我们又在与痛经关系更为密切的催产素致痛经模型上对它们的镇痛作用进行了进一步考察。2、DSS-A-E和DSS-A-N-30对催产素致痛经模型小鼠的镇痛作用为提高子宫对催产素的敏感性，造模前3天小鼠皮下注射己烯雌酚（0.2mg/只，1次/d，连续3天），实验当天以20 IU/kg催产素给予小鼠腹腔注射，小鼠因子宫痉挛疼痛而出现扭体反应，在30 min以内扭体次数较多，提示成功建立了小鼠痛经模型。DSS（9000.0 mg/kg）可明显减少模型小鼠的扭体次数。DSS-A-E（115.0、230.0和460.0 mg/kg）也具有减少小鼠扭体次数的作用，其中，230.0和460.0 mg/kg剂量组的作用最为明显。DSS-A-N-30（19.8、39.6和79.2 mg/kg）的作用与DSS和DSS-A-E类似，以低剂量（19.8 mg/kg）作用最为明显。上述结果表明DSS-A-E和DSS-A-N-30对催产素致痛经小鼠的疼痛具有明显改善作用。上述研究结果表明，DSS-A-E和DSS-A-N-30对醋酸致痛小鼠、催产素致痛经模型小鼠均具有镇痛作用，提示二者可能具有治疗痛经的作用。三、当归芍药散活性部位DSS-A-E和DSS-A-N-30对大鼠离体子宫平滑肌收缩的影响在本部分实验中，采用未孕动情期大鼠离体子宫平滑肌，观察药物对其自发性收缩及对子宫收缩促进剂(催产素、PGF_2α、乙酰胆碱)所诱发的子宫痉挛性收缩的影响，进而应用KCl致子宫平滑肌强直收缩模型和催产素在无钙平衡盐溶液中致子宫平滑肌持续收缩模型，从细胞内钙离子浓度变化的角度考察药物影响子宫平滑肌收缩的可能机制。1、DSS-A-E和DSS-A-N-30对大鼠离体子宫平滑肌自发性收缩的影响溶剂对照组子宫平滑肌条在处理后30min内自发性收缩无明显变化。浓度为7140.0 mg/L的DSS对子宫平滑肌条自发性收缩具有抑制作用，这种作用在处理10min后基本达到最强，在20min仅略有增强，并至少维持到30min。DSS-A-E（16.4、32.8、49.2和65.7 mg/L）在处理10 min后即表现出明显的抑制作用，该作用随着时间的延长而增强，在20 min后达到最大药效，并至少维持到30 min；同时这种抑制作用随DSS-A-E浓度的增加而增强，中、高浓度（49.2、65.7 mg/L）的抑制率约为60％。DSS-A-N-30（141.5、283.0和566.0 mg/L）在处理10 min后抑制作用最强，其后抑制作用略有下降，抑制率最高可达40％左右（283.0、566.0mg/L）。结果表明DSS-A-E和DSS-A-N-30能明显抑制大鼠子宫平滑肌条的自发性收缩。2、DSS-A-E和DSS-A-N-30对子宫收缩促进剂(催产素、PGF_2α、乙酰胆碱)致离体子宫平滑肌剧烈收缩的影响2．1 DSS-A-E和DSS-A-N-30对催产素致离体子宫平滑肌剧烈收缩的影响正常大鼠子宫平滑肌条经催产素（10 IU/L）处理后剧烈收缩，收缩曲线下面积（AUC）增加、收缩频率加快、收缩张力增加。DSS（7140.0 mg/L）对催产素所致子宫平滑肌条AUC的增加、收缩频率的加快以及收缩力的增加均具有明显的抑制作用。DSS-A-E（16.4、32.8、49.2和65.7 mg/L）可以显著抑制催产素引起的大鼠离体子宫平滑肌条AUC增加，浓度在32.8 mg/L以上的DSS-A-E能同时抑制收缩频率的加快和收缩力的增加，且该作用随浓度增加而增强。DSS-A-N-30（141.5、283.0和566.0 mg/L）可以显著抑制肌条AUC增加和收缩频率加快，浓度为566.0 mg/L的DSS-A-N-30能同时抑制收缩力的增加，且这种抑制作用也随浓度增加而增强。以上结果表明DSS-A-E和DSS-A-N-30能明显抑制催产素引起的大鼠离体子宫平滑肌条剧烈收缩。2．2 DSS-A-E和DSS-A-N-30对PGF_2α致离体子宫平滑肌剧烈收缩的影响正常子宫平滑肌条经PGF_2α处理后剧烈收缩，DSS（7140.0 mg/L）能显著抑制收缩频率的加快和收缩力的增加，对子宫平滑肌条AUC的增加有抑制的趋势。DSS-A-E在浓度为16.4、32.8、49.2及65.7 mg/L时可显著抑制收缩力增加，且这种抑制作用随浓度的增加而增强，49.2 mg/L以上浓度时能同时抑制肌条AUC的增加，但各浓度对收缩频率加快均无明显影响。DSS-A-N-30（141.5、283.0和566.0mg/L）对肌条AUC的增加有明显抑制作用，283.0和566.0 mg/L浓度能同时抑制收缩频率加快，高浓度可同时抑制收缩力增加。以上结果表明DSS-A-E和DSS-A-N-30可以显著抑制PGF_2α引起的大鼠离体子宫平滑肌条剧烈收缩。2．3 DSS-A-E和DSS-A-N-30对乙酰胆碱致离体子宫平滑肌剧烈收缩的影响乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）也可导致正常离体子宫平滑肌剧烈收缩，DSS（7140.0 mg/L）可以显著抑制ACh引起的大鼠离体子宫平滑肌条AUC的增加、收缩频率的加快以及收缩力的增加。DSS-A-E（32.8、49.2、65.7 mg/L）可显著抑制ACh所致平滑肌条AUC的增加，DSS-A-E在浓度为49.2和65.7 mg/L时可同时抑制收缩频率的加快和收缩力的增加，且这种抑制作用随浓度的增加而增强。DSS-A-N-30（283.0和566.0 mg/L）可显著抑制肌条AUC的增加，浓度为283.0 mg/L时对肌条收缩力的增加有显著抑制作用，但各浓度对收缩频率的加快均无明显作用。以上结果表明DSS-A-E和DSS-A-N-30对ACh引起大鼠子宫平滑肌条的剧烈收缩具有显著抑制作用。2．4 DSS-A-E和DSS-A-N-30对KCl致离体子宫平滑肌强直收缩的影响KCl去极化可使平滑肌细胞钙通道开放，引起细胞外钙离子内流致子宫平滑肌强直收缩。DSS（7140.0 mg/L）可以显著缓解KCl引起的离体子宫平滑肌条的强直收缩，随着时间的延长而作用增强，处理30 min其抑制率可达50％左右。DSS-A-E（16.4、32.8、49.2和65.7 mg/L）也具有明显的缓解作用，且随浓度的增加和时间的延长其作用增强，浓度在32.8 mg/L以上的DSS-A-E作用30 min时抑制作用最强，抑制率约40％。而DSS-A-N-30在浓度为141.5、283.0和566.0 mg/L时对KCl致离体子宫平滑肌强直收缩无明显作用。以上结果表明DSS-A-E能明显缓解KCl致离体子宫平滑肌条强直收缩，而DSS-A-N-30无明显作用，提示DSS-A-E可以显著抑制胞外钙离子内流而DSS-A-N-30则无明显作用。3、DSS-A-E和DSS-A-N-30对催产素在无钙溶液中诱发离体子宫平滑肌持续收缩的影响催产素在无钙平衡盐溶液中可引起子宫平滑肌持续收缩，这是细胞内肌浆网钙库释放的结果，此作用在15min内基本保持不变。DSS（7140.0 mg/L）处理5 min后可显著抑制催产素在无钙平衡盐溶液中引起的离体子宫平滑肌条持续收缩，并维持至15min。高浓度的DSS-A-E（65.7 mg/L）与DSS的结果类似，而中浓度（49.2mg/L）在处理15min后才具有明显抑制作用。各浓度DSS-A-N-30（141.5、283.0、566.0 mg/L）在处理5 min后均有显著抑制作用，但随时间延长该作用逐渐减弱，在处理15 min后仅高浓度（566.0 mg/L）组与对照组相比仍有统计学意义。以上结果表明，DSS-A-E和DSS-A-N-30可以抑制催产素在无钙平衡盐溶液中引起的子宫平滑肌条持续收缩，但作用特点有所不同，DSS-A-E作用缓慢而温和，DSS-A-N-30作用迅速但随着时间的延长其抑制作用减弱，提示二者均可显著抑制细胞内钙库释放引起的细胞内钙离子浓度增加。总结离体平滑肌收缩实验的结果可见，DSS-A-E和DSS-A-N-30均可以抑制大鼠离体子宫平滑肌的自发性收缩及由子宫收缩促进剂(催产素、PGF_2α和ACh)引起的离体子宫平滑肌剧烈收缩，提示DSS-A-E和DSS-A-N-30可能对正常及痛经情况下子宫平滑肌的收缩具有抑制作用；DSS-A-E可显著抑制KCl引起的离体子宫平滑肌强直收缩，DSS-A-E和DSS-A-N-30均可抑制催产素在无钙平衡盐溶液中引起的离体子宫平滑肌持续收缩，提示DSS-A-E能通过抑制细胞外钙离子内流和细胞内钙库释放两种途径降低细胞内钙离子浓度而抑制子宫平滑肌收缩，而DSS-A-N-30主要通过抑制细胞内钙库释放降低细胞内钙离子浓度来抑制子宫平滑肌收缩。四、当归芍药散活性部位DSS-A-E和DSS-A-N-30对小鼠生殖内分泌系统的调节作用生殖内分泌系统失衡是导致痛经的重要原因，主要表现为黄体期及月经前期雌激素水平升高、体内PGF_2α和血管加压素过度合成、释放等。本研究口服给予正常成年ICR小鼠药物12天，观察DSS-A-E和DSS-A-N-30对小鼠生殖内分泌系统的调节作用。1、DSS-A-E和DSS-A-N-30对正常ICR小鼠动情周期及子宫和卵巢重量的影响DSS-A-E（115.0、230.0和460.0 mg/kg）和DSS-A-N-30（19.8、39.6和79.2 mg/kg）与DSS（9000.0 mg/kg）作用相似，对正常雌性小鼠动情期和动情间期的持续时间以及子宫和卵巢重量均无明显影响。2、DSS-A-E和DSS-A-N-30对正常ICR小鼠血清E₂的影响给药12天后，与正常对照组相比较，DSS（9000.0 mg/kg）组小鼠血清E₂水平显著降低，以小鼠动情期的血清E₂水平下降最为明显。DSS-A-E（115.0、230.0和460.0 mg/kg）和DSS-A-N-30（19.8、39.6和79.2 mg/kg）的作用与DSS类似，其中高剂量（DSS-A-E 460.0 mg/kg，DSS-A-N-30 79.2 mg/kg）组小鼠动情期血清E₂水平降低最为明显。结果表明，DSS-A-E和DSS-A-N-30能降低小鼠血清E₂水平，且以降低动情期血清E₂水平为主。3、DSS-A-E和DSS-A-N-30对正常小鼠垂体LH表达水平的影响蛋白免疫印迹实验的结果表明，小鼠垂体有LH蛋白表达。与正常对照组比较，小鼠给予DSS（9000.0 mg/kg）12天后，其垂体LH蛋白表达略有增加，而给予DSS-A-E（115.0和230.0 mg/kg）和DSS-A-N-30（19.8和39.6 mg/kg）后垂体LH蛋白表达明显降低。结果表明DSS-A-E和DSS-A-N-30能下调小鼠垂体LH蛋白表达。4、DSS-A-E和DSS-A-N-30对催产素致痛经模型小鼠子宫组织PGF_2α的影响DSS-A-E（460.0 mg/kg）和DSS-A-N-30（79.2 mg/kg）均能降低子宫组织PGF_2α水平，以DSS-A-N-30作用最为明显，与阳性药阿司匹林（100.0 mg/kg）和DSS（9000.0 mg/kg）作用一致。结果表明，DSS-A-E和DSS-A-N-30可以降低子宫组织PGF_2α水平。通过以上研究主要得出以下结论：1．DSS-A-E和DSS-A-N-30能明显减少醋酸致痛小鼠和催产素致痛经模型小鼠的扭体次数，提示DSS-A-E和DSS-A-N-30可能具有治疗痛经的作用。2．DSS-A-E和DSS-A-N-30可以抑制大鼠离体子宫平滑肌的自发性收缩及由子宫收缩促进剂(催产素、PGF_2α、和ACh)引起的离体子宫平滑肌剧烈收缩，提示DSS-A-E和DSS-A-N-30可能对正常及痛经情况下子宫平滑肌的收缩均具有抑制作用。3．DSS-A-E可以显著抑制KCI引起的离体子宫平滑肌强直收缩，而DSS-A-N-30则作用不明显；DSS-A-E和DSS-A-N-30均可抑制催产素在无钙平衡盐溶液中引起的离体子宫平滑肌持续收缩，其中DSS-A-E作用缓慢而持久，DSS-A-N-30作用迅速但随时间延长作用有所减弱，提示DSS-A-E能通过抑制细胞外钙离子内流和细胞内钙库释放两种途径降低细胞内钙离子浓度来抑制子宫平滑肌收缩，而DSS-A-N-30主要通过抑制细胞内钙库释放来降低细胞内钙离子浓度，从而抑制子宫平滑肌收缩。4．DSS-A-E和DSS-A-N-30口服给药能明显降低正常小鼠动情期血清E2水平，下调垂体LH表达，提示DSS-A-E和DSS-A-N-30有调节生殖内分泌系统的作用。5．DSS-A-N-30可以显著降低子宫组织PGF_2α水平，提示降低子宫组织PGF_2α水平可能是DSS-A-N-30治疗痛经的作用机制之一。6．DSS-A-E和DSS-A-N-30可能是DSS治疗痛经的活性部位，镇痛、对抗子宫痉挛和调节生殖内分泌系统平衡可能是其治疗痛经的作用机理。